Solubilization and structural characterization of Arabidopsis thaliana seed oleosins

Les corps lipidiques (CLs) sont des organites de stockage de lipides neutres rencontrés dans des organismes très variés, depuis les procaryotes jusqu’aux organismes complexes (animaux, végétaux). La surface des CLs est constituée d’une monocouche de phospholipides (PLs) entourant un coeur hydrophobe dans lequel sont stockés les lipides neutres. La monocouche de PLs est associée plus ou moins étroitement avec des protéines structurales, capables de stabiliser les CLs et d’accompagner certaines de leurs modifications morphologiques. Dans les graines de plantes oléagineuses, les CLs sont stabilisés par les oléosines. Ces protéines contiennent le plus long domaine hydrophobe connu (70 résidus) situé entre deux extrémités N et C-terminales hydrophiles. Leur mode d’association avec les CLs n’est pas connu et la littérature fait état de résultats contradictoires concernant leur structure secondaire. Nous avons montré que les oléosines de graines d’Arabidopsis thaliana sont maintenues en solution par différentes catégories de surfactants, comme les détergents anioniques ou des polymères amphiphiles appelés amphipols (Apols). La détermination de la structure secondaire des oléosines maintenues en solution dans ces différents surfactants, par dichroïsme circulaire utilisant le rayonnement synchrotron, a mis en évidence des profils contrastés. Les détergents chargés augmentent le contenu en hélices α des oléosines alors que des proportions plus importantes de feuillets β sont observées avec le détergent zwitterionique (Foscholine-12) ou les Apols. Afin d’obtenir un profil structural modèle dans un système proche du naturel, nous avons réalisé une expression hétérologue d’une isoforme d’oléosine pour la cibler dans les CLs de Saccharomyces cerevisiae. Les CLs purifiés de levures restent intacts et contiennent une forte majorité de cette isoforme d’oléosine à leur surface. Nous avons été les premiers à montrer que les oléosines étaient repliées dans un tel environnement, avec un profil structural majoritairement β. Celui-ci se rapproche du profil observé en Foscholine-12. Ce détergent est par conséquent un outil de choix pour envisager des études structurales plus résolutives (structures tridimensionnelles).Lipid Bodies (LBs) are neutral lipid storage organelles found in various organisms from procaryotic cells to complex organisms. These neutral lipids are packed into the core of the particle which is surrounded by a phospholipid monolayer. The surface of LBs is more or less tightly associated with structural proteins involved in their stabilization and able to assist modifications of their shape or size. In oleaginous seeds, LBs are stabilized by oleosins. These proteins contain the longest known hydrophobic domain (70 residues) flanked by hydrophilic N and C-termini. The way of association of these proteins with LBs is poorly known and secondary structure descriptions in the literature are contradictory. We have shown that Arabidopsis thaliana seed oleosins could be solubilized by various surfactants such as detergents or amphiphatic polymers called amphipols (Apols). Secondary structure determination of solubilized oleosins using synchrotron radiation circular dichroism gave contrasted profiles. Negatively charged detergents increase the α-helix content of oleosins whereas the zwitterionic detergent (Foscholine-12) or Apols allow higher proportions of β-sheets. In order to get closer to the natural environment of olesins, we have opted for the heterologous expression of one oleosin isoform in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This approach allows the biological targeting and insertion of oleosins into cytosolic LBs. Purified yeast LBs remain intact and contain a large majority of oleosins at their surface. In this natural like environment, oleosins are folded and contain a majority of β-sheets. This secondary structure profile is close to that of oleosins solubilized by Foscholin-12, making it a suitable detergent for more resolutive structural studies (three-dimensional structures)

Mise en évidence des modifications métaboliques induites par l'accumulation de lipides dans la levure S. cerevisiae par sFTIR sur cellules uniques

L'utilisation combinée du faisceau synchrotron de la ligne SMIS et d'hémisphère en ZnSe nous a permis d'obtenir des spectres FTIR sur cellules uniques. Nos résultats ont révélé une hétérogénéité du métabolisme cellulaire au sein d'une population issue d'une même souche. Nous avons également observé de fortes modifications entre souches ayant une capacité variable de stockage des lipides neutres.The combination of SMIS beamline synchrotron radiation and ZnSe hemisphere led us to obtain single-cell FTIR spectra. Our results revealed cell metabolism heterogeneity in a population coming from a single clone. We also observed clear modi bc0 d82cations bet bc0 c59een strains exhibiting various capacities in neutral lipid storage

Single cell synchrotron FT-IR microspectroscopy reveals a link between neutral lipid and storage carbohydrate fluxes in S. cerevisiae

In most organisms, storage lipids are packaged into specialized structures called lipid droplets. These contain a core of neutral lipids surrounded by a monolayer of phospholipids, and various proteins which vary depending on the species. Hydrophobic structural proteins stabilize the interface between the lipid core and aqueous cellular environment (perilipin family of proteins, apolipoproteins, oleosins). We developed a genetic approach using heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae of the Arabidopsis thaliana lipid droplet oleosin and caleosin proteins AtOle1 and AtClo1. These transformed yeasts overaccumulate lipid droplets, leading to a specific increase in storage lipids. The phenotype of these cells was explored using synchrotron FT-IR microspectroscopy to investigate the dynamics of lipid storage and cellular carbon fluxes reflected as changes in spectral fingerprints. Multivariate statistical analysis of the data showed a clear effect on storage carbohydrates and more specifically, a decrease in glycogen in our modified strains. These observations were confirmed by biochemical quantification of the storage carbohydrates glycogen and trehalose. Our results demonstrate that neutral lipid and storage carbohydrate fluxes are tightly connected and co-regulated

Link between neutral lipid and storage carbohydrate fluxes in S. cerevisiae revealed by Single Cell Synchrotron Fourier Tranform-Infrared Microspectroscopy

National audienceIn most organisms, storage lipids are packaged into specialized structures called lipid bodies. They contain a core of storage neutral lipids surrounded by a monolayer of phospholipids, and numerous proteins which vary strongly according to the species. In particular, structural hydrophobic proteins stabilize the interface between lipid core and cellular aqueous environment (PAT proteins, apolipoproteins, oleosins). We developed a genetic approach using Saccharomyces cerevisiae to obtain heterologous expression of Arabidopsis thaliana lipid body proteins: oleosin AtOle1 or caleosin AtClo1. These transformed yeasts overaccumulated lipid bodies, leading to a specific increase in storage lipids. Exploration of these cells using single cells FT-IR microspectroscopy was done to understand the dynamics of lipid storage and carbon fluxes by measuring the changes of spectral fingerprints of biological macromolecules. Statistical analysis of data shows a clear effect on carbohydrate pool and more precisely, we measured a decrease of glycogen in our modified strains. These observations were confirmed using biochemical quantification of storage carbohydrates, glycogen and trehalose. Our results demonstrated that neutral lipid and storage carbohydrate fluxes were tightly connected and co-regulated

Link between neutral lipid and storage carbohydrate fluxes in S. cerevisiae revealed by Single Cell Synchrotron Fourier Tranform-Infrared Microspectroscopy

In most organisms, storage lipids are packaged into specialized structures called lipid bodies. They contain a core of storage neutral lipids surrounded by a monolayer of phospholipids, and numerous proteins which vary strongly according to the species. In particular, structural hydrophobic proteins stabilize the interface between lipid core and cellular aqueous environment (PAT proteins, apolipoproteins, oleosins). We developed a genetic approach using Saccharomyces cerevisiae to obtain heterologous expression of Arabidopsis thaliana lipid body proteins: oleosin AtOle1 or caleosin AtClo1. These transformed yeasts overaccumulated lipid bodies, leading to a specific increase in storage lipids. Exploration of these cells using single cells FT-IR microspectroscopy was done to understand the dynamics of lipid storage and carbon fluxes by measuring the changes of spectral fingerprints of biological macromolecules. Statistical analysis of data shows a clear effect on carbohydrate pool and more precisely, we measured a decrease of glycogen in our modified strains. These observations were confirmed using biochemical quantification of storage carbohydrates, glycogen and trehalose. Our results demonstrated that neutral lipid and storage carbohydrate fluxes were tightly connected and co-regulated

Végétalisation du corps lipidique de S. cerevisiae pour l'étude structurale de protéines intégrales et la production de biomasse lipidique

Dans le contexte actuel d’épuisement des ressources fossiles et de protection de l’environnement, la valorisation énergétique des huiles issues de la biomasse et la chimie verte prennent de l’importance. En effet, ces huiles et leurs dérivés biodégradables peuvent venir en remplacement des produits d'origine fossile. Ils sont de plus en plus retrouvés dans les produits de grande consommation (savon, produits d’entretien) ou industriels (solvants, lubrifiants). Deux sources sont envisagées, celles des huiles végétales déjà bien implantées, et celle des huiles produites à partir de microorganismes, actuellement en plein essor. Nos travaux visent à identifier des facteurs influant sur la qualité et la quantité de lipides produits par l’amélioration des plantes ou la transformation génétique de levures. Les lipides de réserve sont stockés dans des granules, les corps lipidiques, puis mobilisés en cas de besoins nutritionnels. Ces structures sont présentes chez les eucaryotes supérieurs (mammifères, plantes) et chez certains unicellulaires (bactéries, levures). Les corps lipidiques sont constitués d’un cœur de lipides neutres, entourés par une monocouche de phospholipides dans laquelle sont insérées de nombreuses protéines. En particulier, il existe des protéines structurales hydrophobes qui stabilisent l'interface entre ces inclusions lipidiques et le milieu aqueux (protéines PAT, apolipoprotéines, oléosines). Les oléosines, de masse comprise entre 15 et 25 kDa, sont les protéines majoritaires du corps lipidique de plantes et recouvrent entièrement sa surface. Grâce à l'expression hétérologue chez S. cerevisiae de deux de ces protéines, l'oléosine AtOle1 et la caléosine AtClo1 de la graine d’Arabidopsis thaliana, nous avons démontré que ces protéines s'insèrent à la surface des corps lipidiques en très grande quantité et favorisent la prolifération de ces structures. Nous avons obtenu une augmentation de + 46.6 % de la teneur en acides gras pour la souche exprimant AtClo1. Le travail se poursuit autour de cette souche modifiée pour le développement de systèmes biologiques performants de production des huiles. Nous utilisons également ces corps lipidiques "végétalisés" pour déterminer le repliement des oléosines par des analyses structurales (SRCD) de ces protéines très hydrophobes dans un environnement naturel afin de développer leur valorisation comme émulsifiant vert par exempl