EFHB is a novel cytosolic Ca²+ sensor that modulates STIM1-SARAF interaction

FUNDAMENTOS/OBJETIVOS: STIM1 y Orai1 son los componentes clave de la entrada de Ca2+ en la tienda (SOCE). Entre las proteínas que participan en la regulación de la SOCE, la SARAF previene la activación espontánea de la SOCE y modula la función de STIM1. MÉTODOS: Se estimó la movilización de Ca2+ citosólico en células cargadas de fura-2 usando un microscopio invertido de epifluorescencia. La interacción de STIM1 con Orai1, EFHB (miembro de la familia B del dominio de la mano EF, también conocido como CFAP21) y SARAF se detectó mediante inmunoprecipitación seguida de Western blotting utilizando anticuerpos específicos. La participación de EFHB en la translocación de NFAT al núcleo se detectó mediante microscopía confocal. RESULTADOS: Aquí reportamos la identificación del EFHB como un nuevo regulador SOCE. El EFHB interactúa con el STIM1 al agotarse el almacenamiento y se disocia a través de un mecanismo dependiente de Ca2+-. El silenciamiento mediado por el ARNi así como los estudios de sobreexpresión revelaron que el EFHB juega un papel relevante en la interacción de STIM1 y Orai1 al agotarse las reservas, la activación de la translocación de SOCE y NFAT del citosol al núcleo. El silenciamiento de la expresión de la EFHB suprimió la disociación de la SARAF de la STIM1, lo que indica que la EFHB podría desempeñar un papel importante en la interacción dinámica entre ambas proteínas, lo que es pertinente para la activación de los canales de Orai1 al agotarse el almacenamiento de Ca2+ y su posterior modulación mediante la inactivación lenta dependiente del Ca2+. CONCLUSIÓN: Nuestros resultados indican que el EFHB es un nuevo regulador SOCE que modula la interacción STIM1-SARAF.BACKGROUND/AIMS: STIM1 and Orai1 are the key components of store-operated Ca2+ entry (SOCE). Among the proteins involved in the regulation of SOCE, SARAF prevents spontaneous activation of SOCE and modulates STIM1 function. METHODS: Cytosolic Ca2+ mobilization was estimated in fura-2-loaded cells using an epifluorescence inverted microscope. STIM1 interaction with Orai1, EFHB (EF-hand domain family member B, also known as CFAP21) and SARAF was detected by immunoprecipitation followed by Western blotting using specific antibodies. The involvement of EFHB in the translocation of NFAT to the nucleus was detected by confocal microscopy. RESULTS: Here, we report the identification of EFHB as a new SOCE regulator. EFHB interacts with STIM1 upon store depletion and dissociates through a Ca2+- dependent mechanism. RNAi-mediated silencing as well as overexpression studies revealed that EFHB plays a relevant role in the interaction of STIM1 and Orai1 upon store depletion, the activation of SOCE and NFAT translocation from the cytosol to the nucleus. Silencing EFHB expression abolished the dissociation of SARAF from STIM1, which indicates that EFHB might play an important role in the dynamic interaction between both proteins, which is relevant for the activation of Orai1 channels upon Ca2+ store depletion and their subsequent modulation via slow Ca2+-dependent inactivation. CONCLUSION: Our results indicate that EFHB is a new SOCE regulator that modulates STIM1-SARAF interaction.• Ministerio de Economía y Competitividad. Contrato Juan de la Cierva IJCI-2015-25665, para Isaac Jardín Polo • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Contrato IB16046, para José Javier López Barba • Ministerio de Economía y Competitividad. Subvención BFU2016-74932-C2-1-P, para Letizia Albarrán Alonso • Ministerio de Economía y Competitividad. Subvenciones Subvenciones BFU2013-45564-C2-1-P/2-P y BFU2016-74932-C2-1-P/2-P • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Subvenciones IB16046 y GR18061peerReviewe

Involvement of stanniocalcins in the deregulation of glycaemia in obese mice and type 2 diabetic patients

Las estanniocalcinas se expresan en el tejido del páncreas, y se sugirió una correlación directa entre la insulina circulante y las concentraciones de STC2 en el ser humano. Aquí, mostramos una correlación significativa entre STC1 y tanto la glucemia como la hemoglobina glicosilada entre los pacientes con DM2, mientras que los pacientes con DM2 que presentan los mayores valores de hemoglobina glicosilada exhibieron la menor expresión de STC2. Sin embargo, el tratamiento de los pacientes con fármacos antiglicémicos no modifica significativamente la expresión de ambas STC. Por otra parte, los ratones STC2-/- que mostraron sobrepeso neonatal y adulto presentaron además una glucemia desregulada cuando fueron alimentados con una dieta hipercalórica (pellet de cría, BP). Esta alteración es más evidente en las primeras etapas de la vida animal. La glucemia desregulada en estos ratones se confirmó mediante una prueba oral de glucosa. Además, los ratones STC2-/- presentan un aumento del tamaño del páncreas; así, el análisis histológico revela que los ratones WT responden a la dieta BP aumentando el tamaño de los islotes pancreáticos a través de la inducción de la división celular, y los ratones STC2-/- carecen de este mecanismo compensatorio. Contrariamente, los ratones alimentados con STC2-/- muestran un mayor número de islotes pero de tamaño similar a los alimentados con el pellet regular. El análisis histopatológico demuestra la alteración de la estructura de los tejidos y las infiltraciones de eritrocitos en los ratones STC2-/-, posiblemente debido al estrés evocado por la dieta BP. Por último, se observó una mayor inmunotinción de glucagón en el islote de los ratones STC2-/-, y el ensayo ELISA de glucagón confirmó el aumento del glucagón circulante. En resumen, presentamos pruebas del papel de los STC, principalmente el STC2, como posible marcador temprano durante el desarrollo de la diabetes mellitus.Stanniocalcins are expressed in the pancreas tissue, and it was suggested a direct correlation between circulating insulin and STC2 concentrations in human. Here, we show a significant correlation between STC1 and both glycaemia and glycosylated haemoglobin among DM2 patients, while DM2 patients who present the greatest glycosylated haemoglobin values exhibited the lowest STC2 expression. However, treatment of patients with antiglycaemic drugs does not significantly modify the expression of both STCs. On the other hand, STC2-/- mice that exhibited neonatal and adult overweight further presented deregulated glycaemia when they were feed with a hypercaloric diet (breeding pellet, BP). This alteration is more evident at the early stages of the animal life. Deregulated glycaemia in these mice was confirmed using glucose oral test. In addition, STC2-/- mice present enhanced pancreas size; thus, the histological analysis reveals that WT mice respond to BP diet by increasing the size of the pancreatic islets through inducing cell division, and STC2-/- mice lack this compensatory mechanism. Contrary, BP fed STC2-/- mice show enhanced number of islets but of similar size than those fed with regular pellet. Histopathological analysis demonstrates tissue structure disruption and erythrocytes infiltrations in STC2-/- mice, possibly due to the stress evoked by the BP diet. Finally, enhanced glucagon immunostaining was observed in the islet of STC2-/- mice, and the glucagon ELISA assay confirmed the increase in the circulating glucagon. Summarizing, we present evidence of the role of STCs, mainly STC2, as a possible early marker during development of diabetes mellitus.• Ministerio de Economía y Competitividad. Becas 2013‐45564C2‐1‐P, BFU‐2016‐74932‐C2‐1‐P • Programa Juan de la Cierva. Becas IJCI‐2015‐25665, JC‐2012‐ 2934 • Junta de Extremadura. Beca PRIIB16046peerReviewe

The store-operated Ca2+ channel Orai1α is required for agonist-evoked NF-kB activation by a mechanism dependent on PKCβ2

La entrada de Ca2+ operada por almacenamiento es un mecanismo ubicuo de afluencia de Ca2+ en células de mamíferos que regula diversos procesos fisiológicos. La identificación de dos formas de Orai1, el canal operado por almacenamiento predominante, Orai1α y Orai1β, plantea la cuestión de si regulan de forma diferencial la función celular. Orai1α es el Orai1 completo, que contiene 301 aminoácidos, mientras que Orai1β carece de los 63 aminoácidos N-terminales. Aquí, utilizando una combinación de bioquímica e imagen combinada con el uso de células de riñón embrionario humano 293 KO, que carecen del Orai1 nativo, transfectadas con plásmidos que codifican para Orai1α u Orai1β, mostramos que Orai1α desempeña un papel relevante en la actividad transcripcional NF-κB inducida por agonistas. Por el contrario, Orai1β funcional no es necesaria para la activación de estos factores de transcripción. El papel de Orai1α en la activación de NF-κB es totalmente dependiente de la afluencia de Ca2+ e implica la activación de PKCβ. Nuestros resultados indican que Orai1α interactúa con PKCβ2 mediante un mecanismo que implica a la región de asociación AKAP79 exclusiva de Orai1α, lo que sugiere fuertemente un papel de AKAP79 en este proceso. Estos hallazgos proporcionan evidencias del papel de Orai1α en la actividad transcripcional NF-κB inducida por agonistas y revelan diferencias funcionales entre las variantes de Orai1.Store-operated Ca2+ entry is a ubiquitous mechanism for Ca2+ influx in mammalian cells that regulates a variety of physiological processes. The identification of two forms of Orai1, the predominant store-operated channel, Orai1α and Orai1β, raises the question whether they differentially regulate cell function. Orai1α is the full-length Orai1, containing 301 amino acids, whereas Orai1β lacks the N-terminal 63 amino acids. Here, using a combination of biochemistry and imaging combined with the use of human embryonic kidney 293 KO cells, missing the native Orai1, transfected with plasmids encoding for either Orai1α or Orai1β, we show that Orai1α plays a relevant role in agonist-induced NF-κB transcriptional activity. In contrast, functional Orai1β is not required for the activation of these transcription factors. The role of Orai1α in the activation of NF-κB is entirely dependent on Ca2+ influx and involves PKCβ activation. Our results indicate that Orai1α interacts with PKCβ2 by a mechanism involving the Orai1α exclusive AKAP79 association region, which strongly suggests a role for AKAP79 in this process. These findings provide evidence of the role of Orai1α in agonist-induced NF-κB transcriptional activity and reveal functional differences between Orai1 variants.• Agencia Española de Investigación. Proyecto PID2019-104084GB-C21/AEI/ 10.13039/501100011033 • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Becas IB20007 y GR21008, para José Antonio Rosado Dionisio • Junta de Extremadura y Fondo Europeo de Desarrollo Regional. Ayudas n. TA18011 y TA18054, para José Javier López Barba y Isaac Jardín Polo • Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Contrato para Joel Nieto Felipe y José Sánchez ColladopeerReviewe

Similarities and differences between the Orai1 variants: Orai1α and Orai1β

Orai1, el primer miembro identificado de la familia de proteínas Orai, se expresa de forma ubicua en el reino animal. Orai1 se caracterizó inicialmente como el canal responsable de la entrada de calcio de calcio (SOCE), un importante mecanismo que permite incrementos de la concentración de calcio citosólico citosólica de calcio tras la generación de IP3 mediada por receptores, lo que provoca el agotamiento de los almacenes intracelulares de Ca2+. Además, las pruebas actuales apoyan que la expresión o función anormal de Orai1 subyace a varios trastornos. Orai1 es, junto con STIM1, el elemento clave de SOCE, que conduce la liberación de Ca2+ (CRAC) y, en asociación con TRPC1, la corriente de Ca2+ operada por almacenamiento (SOC). Además, Orai1 participa en vías no capacitativas, como la corriente de Ca2+ regulada por araquidonato o por LTC4. o el canal de Ca2+ regulado por LTC4 (ARC/LRC), el influjo de Ca2+ independiente del almacén activado por la vía secretoria Ca2+-ATP1. (SPCA2) y el canal 3 de K+ activado por Ca2+ de pequeña conductancia (SK3). Además, Orai1 posee dos variantes, Orai1α y Orai1β, esta última carece de 63 aminoácidos en N-terminal en comparación con la forma Orai1 completa, lo que confiere características distintas a cada variante. Aquí revisamos los conocimientos actuales sobre las diferencias entre Orai1α y Orai1β, las implicaciones de las señales de Ca2+ desencadenadas por cada variante y su efecto modulador en la célula.Orai1, the first identified member of the Orai protein family, is ubiquitously expressed in the animal kingdom. Orai1 was initially characterized as the channel responsible for the storeoperated calcium entry (SOCE), a major mechanism that allows cytosolic calcium concentration increments upon receptor-mediated IP3 generation, which results in intracellular Ca2+ store depletion. Furthermore, current evidence supports that abnormal Orai1 expression or function underlies several disorders. Orai1 is, together with STIM1, the key element of SOCE, conducting the Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) current and, in association with TRPC1, the store-operated Ca2+ (SOC) current. Additionally, Orai1 is involved in non-capacitative pathways, as the arachidonate-regulated or LTC4-regulated Ca2+ channel (ARC/LRC), store-independent Ca2+ influx activated by the secretory pathway Ca2+-ATPase (SPCA2) and the small conductance Ca2+-activated K+ channel 3 (SK3). Furthermore, Orai1 possesses two variants, Orai1α and Orai1β, the latter lacking 63 amino acids in the N-terminus as compared to the full-length Orai1 form, which confers distinct features to each variant. Here, we review the current knowledge about the differences between Orai1α and Orai1 β, the implications of the Ca2+ signals triggered by each variant, and their downstream modulatory effect within the cell.• Agencia Estatal de Investigación. Proyecto PID2019-104084GB-C21/AEI/10.13039/501100011033 • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Subvenciones IB20007 y GR21008, para José Antonio Rosado Dionisio • Junta de Extremadura. Contrato de Alejandro Berna Erro • Junta de Extremadura. Proyecto TA18011 y contrato Juan José López Barba • Agencia Estatal de Investigación. Contratos de José Sánchez Collado y Joel Nieto FelipepeerReviewe