Идентификация UFGT-ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. разработанным способом ПЦР-ПДРФ-генотипирования винограда

The Vitis vinifera L. UFGT gene is one of the diagnostically significant genes for genetic testing of technical grape varieties as well as wine materials and wines produced from them. The strategy for genetic identification of grape varieties and DNA authentication of wine materials that was previously developed by us and is based on direct sequencing of the specific PCR product with a length of 99 bp gave an impulse to prognostic assessment of feasibility of PCR-RFLP analysis for detection of five diagnostically significant polymorphic positions and the following identification of 13 UFGT gene-associated groups of Vitis vinifera L. The aim of this work consisted in identification of UFGT gene-associated groups of Vitis vinifera L. by detection of diagnostically significant polymorphic positions using the developed PCR-RFLP method for genotyping of grape. Objects of research were 24 samples of technical grape varieties. Their sample preparation was carried out by extracting 50–100 mg of mature grape pulp or stone with its mechanical comminution in a mortar and transfer to an Eppendorf-type tube. Then, nucleic acids were extracted using a commercial innuPREP Plant DNA Kit or DiamondDNA Plant kit. PCR-RFLP with the extracted grape DNA was performed with Phire Plant Direct PCR Master Mix and four selected restrictases (PstI, BsaXI, BtsIMutI and HinfI) according to the protocols presented in the paper. The detection of the PCR-RFLP fragments was performed by visualization of electropherograms in a UV transilluminator after horizontal electrophoresis in 2.5% agarose gel with stained TAE buffer. The method for PCR-RFLP genotyping of grapes developed specially for identification of UFGT gene-associated groups of Vitis vinifera L. by detecting diagnostically significant polymorphic positions demonstrated its feasibility when testing 24 samples of technical grape varieties. With that, the positive result was achieved due to the practical ability of each of four selected restrictases to discriminate the strictly specified polymorphic position generating characteristic PCR-RFLP profiles of 13 UFGT gene-associated groups of Vitis vinifera L., seven of which were revealed during this study. Therefore, as a result of the performed study, the genotypic affiliation of several tested grape varieties was established: six samples were identified as representatives of the UFGT gene-associated group No.1; one sample was assigned to gene-associated group No.2; two samples were characterized by the trait of associated group No.3; four samples belonged to group No. 4; one sample to group No. 5; six samples to group No.13.Ген UFGT Vitis vinifera L. является одним из диагностически значимых для генотестирования технических сортов винограда, а также производимых из них виноматериалов и вин. Ранее отработанная нами стратегия геноидентификации сортов винограда и ДНК-аутентификации виноматериалов на основе прямого секвенирования специфичного ПЦР-продукта длиной 99 bp дала импульс к прогнозной оценке применимости ПЦР-ПДРФ-анализа для детекции 5 диагностически значимых полиморфных позиций и последующей идентификации 13 UFGT-ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. Цель работы заключалась в идентификации UFGT-ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. детекцией диагностически значимых полиморфных позиций разработанным способом ПЦР-ПДРФ-генотипирования винограда. Объектами исследований послужили 24 образца технических сортов винограда, пробоподготовку которых проводили извлечением 50–100 мг мякоти зрелого плода или косточки с ее механическим измельчением в ступке и помещением в пробирку типа Эппендорф. Далее проводилось выделение нуклеиновых кислот при помощи коммерческих наборов innuPREP Plant DNA Kit или DiamondDNA Plant kit. Постановку ПЦР-ПДРФ с экстрагированной ДНК винограда осуществляли набором Phire Plant Direct PCR Master Mix и 4 подобранными рестриктазами (PstI, BsaXI, BtsIMutI и HinfI) в соответствии с протоколами, представленными в материалах публикации. Детекцию ПЦР-ПДРФ-фрагментов выполняли визуализацией электрофореграмм в УФ-трансиллюминаторе после горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле с окрашенным TAE-буфером. Способ ПЦР-ПДРФ-генотипирования винограда, специально разработанный для идентификации UFGT-ген-ассоциированных групп Vitis vinifera L. детекцией диагностически значимых полиморфных позиций, продемонстрировал работоспособность при тестировании 24 образцов технических сортов винограда. При этом положительный результат был достигнут благодаря практической способности каждой из четырех подобранных рестриктаз дискриминировать строго определенную полиморфную позицию, генерируя характерные ПЦР-ПДРФ-профили тринадцати UFGT-ген-ассоциированных групп, семь из которых выявлено в ходе настоящего исследования. Таким образом, в результате проведенной работы установлена генотипическая принадлежность целого ряда протестированных сортов винограда: шесть образцов были идентифицированы как представители UFGT-ген-ассоциированной группы № 1; один образец относился к ген-ассоциированной группе № 2; два образца характеризовались признаком ассоциированной группы № 3; четыре образца принадлежали к группе № 4; один образец — к группе № 5; шесть образцов — к группе № 13