Approaches to overcome flow cytometry limitations in the analysis of cells from veterinary relevant species

Heutzutage ist es schwer, sich immunologische Studien ohne Durchflusszytometrie vorzustellen. Wissenschaftlern steht eine große Auswahl an Geräten, Reagenzien und Hilfsmitteln zur Verfügung, um das Immunsystem mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu erforschen. Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die Erhebung wichtiger Informationen über Leukozyten, oder andere Zellpopulationen, in einem Individuum oder einer gesamten Tierart. Dies trägt zu einer Erweiterung des Wissens um das Immunsystem und dessen Funktionsweise bei. Leider ist die Analyse von Zellen mithilfe von Durchflusszytometrie in der Veterinärmedizin mit Schwierigkeiten verbunden. Durch Einschränkungen wie zum Beispiel einem limitierten Angebot an monoklonalen Antikörpern oder einer geringen Auswahl an Fluorochromen, kann das volle Potenzial von Durchflusszytometern in der Veterinärmedizin bislang nicht ausgeschöpft werden. Das Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung der Durchflusszytometrie für immunologische Studien in der Veterinärmedizin zu verdeutlichen und verfeinerte Methoden zu demonstrieren, durch welche die Nutzung der Multiparameter-Durchflusszytometrie vereinfachen werden kann. Diese Methoden umfassen die Kopplung von Fluorenzfarbstoffen an ungefärbte Antikörper, mittels kovalenter Bindung durch kommerziell verfügbare „Antibody Labeling Kits“ oder mittels kurzfristiger Bindung durch auf Fc-Fragmente gerichtete „Zenon Kits“. Darüber hinaus wurde die Nutzung von zweistufigen Reagenzien wie zum Beispiel Farbstoff-markierten Sekundärantikörpern und die häufig verwende Methode der Nutzung von Spezies übergreifenden Antikörpern demonstriert. Zuletzt wurde dargestellt, wie auch Fluoreszenz-markierte Rezeptor-Liganden zu einer Erweiterung des Repertoires an Reagenzien beitragen können. Zusammenfassend konnte die Arbeit demonstrieren, dass mit Hilfe der Anwendung dieser Methoden mindestens 12 Parameter in nicht-traditionellen Tierarten analysiert werden können, welche gleichwertig zu Studien im Mausmodell in der Humanmedizin sind. Dies kann kritische Einblicke in das Immunsystem von veterinärmedizinisch relevanten Tierarten geben, welche kritisch für die Diagnose, Prävention und Behandlung von Krankheiten sind.In recent years it has become difficult to imagine immunological studies without flow cytometry. There is an extensive amount of flow cytometers, reagents and resources available for those who wish to examine the immune system through flow cytometric studies. Through multiparameter analysis it is possible to obtain important information about leukocyte, or other cell populations, in an individual or a species, to establish a broader knowledge about the immune system and its mechanisms. Unfortunately flow cytometric analysis in veterinary species come with obstacles and limitations, such as the lack of commercially available antibodies or limited color choices. This makes it hard to establish state-of-the-art analysis in these species. This work aimed to demonstrate the importance of the use of flow cytometry in immunological studies in veterinary clinical medicine and research and presents refined technical approaches to increase the number of parameters analyzed by flow cytometry per cell sample. These approaches include the direct labeling of monoclonal antibodies with a desired fluorochrome by covalent conjugation using commercially available antibody labeling kits, or for immediate use and increased flexibility using Fc-directed Zenon labeling technology; second step reagents like labeled secondary antibodies are also discussed. In addition, this work demonstrates a popular fall back when using alternative species: cross-reactive antibodies. Lastly, we discussed labeled receptor ligands that can be employed to further enhance a reagent repertoire. These techniques provide the ability to analyze at least 12 parameters in non-traditional animal species on par with advanced studies performed in rodents and humans. This can give insight into immune system of veterinary species where a broader knowledge is crucial for the diagnosis, prevention and treatment of disease and overall animal welfare and health

Approaches to overcome flow cytometry limitations in the analysis of cells from veterinary relevant species

BACKGROUND: Flow cytometry is a powerful tool for the multiparameter analysis of leukocyte subsets on the single cell level. Recent advances have greatly increased the number of fluorochrome-labeled antibodies in flow cytometry. In particular, an increase in available fluorochromes with distinct excitation and emission spectra combined with novel multicolor flow cytometers with several lasers have enhanced the generation of multidimensional expression data for leukocytes and other cell types. However, these advances have mainly benefited the analysis of human or mouse cell samples given the lack of reagents for most animal species. The flow cytometric analysis of important veterinary, agricultural, wildlife, and other animal species is still hampered by several technical limitations, even though animal species other than the mouse can serve as more accurate models of specific human physiology and diseases. RESULTS: Here we present time-tested approaches that our laboratory regularly uses in the multiparameter flow cytometric analysis of ovine leukocytes. The discussed approaches will be applicable to the analysis of cells from most animal species and include direct modification of antibodies by covalent conjugation or Fc-directed labeling (Zenon™ technology), labeled secondary antibodies and other second step reagents, labeled receptor ligands, and antibodies with species cross-reactivity. CONCLUSIONS: Using refined technical approaches, the number of parameters analyzed by flow cytometry per cell sample can be greatly increased, enabling multidimensional analysis of rare samples and giving critical insight into veterinary and other less commonly analyzed species. By maximizing information from each cell sample, multicolor flow cytometry can reduce the required number of animals used in a study