Диференціація генотипів сосни звичайної за поліморфізмом довжини інтронів генів дефензинів

The search for highly informative DNA markers to support the breeding programs aimed at increasing the productivity and biological stability of forest stands is an urgent task, especially in the context of global climate change. In this paper, we first investigate a new type of genetic markers based on the intron length polymorphism (ILP) of defensin genes to determine their informativeness and promising use for the estimation of the potential resistance of pine genotypes to biological damage. In the course of our study we applied the following methods: total DNA isolation by STAB method, PCR amplification with specific primers to pine defensin genes and Heterobasidion annosum s. s., electrophoretic separation of PCR fragments on a polyacrylamide gel under nondenaturing conditions, and also data analysis using software GenAlEx 6.053 and Statistica 10. Having conducted the research, we can present the following results. To investigate the defensin genes polymorphism in pine trees, we used ILP markers. These markers were developed based on the nucleotide sequences of the exons of PsDef1-4 genes. Analysis of PCR fragments obtained after amplification of each pair of primers with genomic DNA of pine showed that only one pair of primers, which is specific to defensin 2 (IPL-PsDef2), forms a wide range of amplified products, indicating their promising use for genetic characterization of genotypes of Scots pine. To clarify the use of IPL-PsDef2 markers for the study of genetic polymorphism we analyzed 196 trees and revealed that the average PIC was 0.287. IPL-PsDef2 markers were used to analyze the different genotypes of Scots pine on the areas affected by root rot disease. Based on the results of cluster analysis, the samples were divided into two groups, which differ in resistance to the root sponge. In addition, we identified PCR fragments that are specific to each of these groups and can serve as markers for the evaluation of the resistance of pine genotypes to Heterobasidion annosum. Thus, our conclusion is as follows: genotyping of defensin genes loci of pine breeding material is promising for the development of environmentally friendly technologies in order to enhance the sustainability of improved genetic material of pine trees to biotic stress.Наведено результати дослідження генотипів сосни звичайної (Pinus sylvestris L.) із використанням молекулярних маркерів на підстаі генетичного поліморфізму довжини інтронів генів дефензинів PsDef1-4. Виявлено високу інформативність маркерів на підстаі інтрону гена PsDef2 (IPL-PsDef2) для дослідження внутрішньовидового поліморфізму в сосни звичайної. Встановлено межі осередка інфекції кореневої губки (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.) в сосновому насадженні за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) із використанням видоспецифічних праймерів. Проведено ДНК-профілювання модельних дерев способом електрофоретичного розділення ампліконів IPL-PsDef2 маркерів. За результатами поліморфізму довжини інтронів генів дефензинів здійснено кластеризацію генотипів сосни звичайної із використанням алгоритму UPGMA. на підстаі дендрограми виділено два кластери генотипів зі 100 % бутстреп підтримкою, які відрізняються за стійкістю до кореневої губки. Методом К-середніх визначено значущість кожного з ампліконів для диференціації генотипів сосни на групи. Виявлено амплікони, які можуть бути генетичними маркерами для оцінки потенційної стійкості генотипів сосни звичайної до кореневої губки. Отримані дані щодо поліморфізму локусів генів дефензинів, а також результати кластерного аналізу вказують на перспективність використання IPL-PsDef2 маркерів для генотипування сосни звичайної

Patterns of expression of lipid-transfer protein gene in organs of Scots pine (Pinus sylvestris L.)

The patterns of lipid-transfer protein PsLTP1 (Pinus sylvestris lipid transfer protein 1) gene expression in the vegetative and generative organs of Scots pine have been studied by the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). It was found that PsLTP1 gene expression is tissue-specific and it changes during ontogenetic development. Effect of phytohormones on PsLTP1 expression level in Scots pine seedlings has been investigated

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ДЕФЕНЗИНОВ И ЛИПИДТРАНСФЕРНОГО ПРОТЕИНА В ПРОРОСТКАХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ, ИНОКУЛИРОВАННЫХ НЕКРОТРОФНЫМ И ХЕМИБИОТРОФНЫМИ ПАТОГЕНАМИ

Fungi from the genera Fusarium, Alternaria, Botrytis and oomycete Phytophthora species cause massive dieback of seedlings in pine nurseries and orchards. The synthesis of antimicrobial compounds, including pathogenesis-related proteins, is one of the main strategies to protect juvenile plants against pathogen attack. Here, we report the data on the expression levels of lipid-transfer protein gene and four defensin genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.) seedlings, inoculated with Alternaria alternata, Fusarium solani and Phytophthora cinnamоmi during the pathological process,assessed bysemiquantitative multiplex RT-PCR.We found that the expression levels of each gene greatly vary between each other and depend on the nature of the pathogen. It was detected that all tested pathogens considerably affect the expression levels of the investigated genes. A significant accumulation of PsDef1 transcripts was observed in pine seedlings 48 hours after inoculation, while the expression of another PsDef4 was upregulated only during first 24 hours of contact with pathogens. ThelevelsofPsDef3 transcriptswereelevatedonly in seedlings, inoculated with F. solani, while the expression of PsLTP1 gene was differentially regulated by all three pathogens, which indicates the dependence of transcriptional response in the seedlings on the nature of pathogen and mechanisms, which are triggered by them on the changes in signal transduction pathways. Collectively, our results suggest the involvement of defensins and lipid-transfer protein in primary defense mechanisms of Scots pine seedlings against tested pathogens.Гриби та ооміцети родів Fusarium, Alternaria, Botrytis, Phytophthora викликають масове відмирання сіянців сосни в теплицях і розсадниках. Одною із основних стратегій захисту ювенільних рослин від патогенів є синтез антимікробних сполук, зокрема, пов'язаних із патогенезом протеїнів. У цій роботі наведено дані щодо рівнів експресії чотирьох генів дефензинів та ліпідтрансферного протеїну в проростках сосни звичайної (Pinus sylvestris L.) протягом перших двох діб після їх інокуляції Alternariaalternata, Fusariumsolani та Phytophthoracinnamоmi. Відносну кількість транскриптів цільових генів визначали методом напівкількісної ПЛР зі зворотною транскрипцією. Виявлено, що досліджувані патогени змінюють рівні експресії усіх п'яти генів, а профіль експресії кожного гена залежать від природи збудника. Так, встановлено істотне збільшення транскриптів гена PsDef1 у сіянцях сосни на 48 годину після інокуляції, тоді як продуктів PsDef4 – тільки протягом перших 24 годин після контакту з патогенами. З'ясовано, що рівень експресії гена PsDef3 підвищувався тільки в проростках, які інокулювали F. solani, тоді як експресія гена PsLTP1 диференційовано регулювалась всіма трьома патогенами. Загалом, результати дослідження вказують, що дефензини та ліпідтрансферний протеїн залучені у первинні реакції відповіді сосни на інфікування збудниками інфекційного вилягання сіянців.Грибы и оомицеты родов Fusarium, Alternaria, Botrytis, Phytophthora вызывают массовое отмирание сеянцев сосны в теплицах и питомниках. Одной из основных стратегий защиты ювенильных растений против патогенов является синтез антимикробных соединений, в частности, связанных с патогенезом протеинов. В этой работе приведены данные об уровнях экспрессии четырех генов дефензинов и липидтрансферного протеина в проростках сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в течение первых двух суток после их инокуляции Alternaria alternata, Fusarium solani и Phytophthora cinnamоmi. Относительное количество транскриптов целевых генов определяли методом полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружено, что исследуемые патогены изменяют уровни экспрессии всех пяти генов, а профиль экспрессии каждого гена зависит от природы возбудителя. Так, установлено существенное увеличение транскриптов гена PsDef1 в сеянцах сосны через 48 ч после инокуляции, тогда как продуктов PsDef4 – только в течение первых 24 ч после контакта с патогенами. Выявлено, что уровень экспрессии гена PsDef3 повышался только в проростках, инокулированных F. solani, в то время как экспрессия гена PsLTP1 дифференциально регулировалась всеми тремя патогенами. Таким образом, результаты исследования указывают на участие дефензинов и липидтрансферного протеина в первичных реакциях ответа сосны на инфицирование возбудителями инфекционного полегания сеянцев

Prokaryotic expression and purification of bioactive defension 2 from Pinus sylvestris L.

Plant defensins are highly stable cysteine-rich peptides consisting of 45–54 amino acid residues with a characteristic conservative βαββ structure stabilized by 4–5 disulfide bridges. These peptides are key molecules of innate immune system in plants. They inhibit growth of many phytopathogenic fungi, and some of them exhibit antibacterial activity. Defensins also possess other biological functions. The multifunctional properties of the defensin peptides make them attractive candidates for creation of new remedies with antimicrobial properties. Elucidation of nature of the structural and functional relationships in the antimicrobial peptides is an essential step in the development of drugs with acti­vity against pathogens. Previously, we have purified endogenous and recombinant Scots pine defensin 1 (PsDef1) demonstrating high activity against fungi and bacteria. Importantly, PsDef1 is the first defensin from coniferous plants whose NMR structure and pro­perties have been thoroughly investigated, also by the authors of this work. In this study, we presented the expression and affinity purification of recombinant defensin 2 from Pinus sylvestris L. (PsDef2), whose sequence has 90 % identity to PsDef1. We used pET32/BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Escherichia coli expression system to produce large quantities of the recombinant PsDef2 peptide conjugated to thioredoxin (TRX). We found that the highest yield of recombinant protein in its soluble form was obtained at 0.5 mM of isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) concentration for 3 h of induction at 25 °С. After isolation of TRX-PsDef2 on HisPurNi-NTA resin, the fusion protein was subjected to proteolytic cleavage by enterokinase. PsDef2 was separated from the proteolytic fragments using the ion exchange on the SP-Sepharose Fast Flow column and a step gradient of 0.05–1 M NaCl. The purity of obtained recombinant PsDef2 was higher than 95 %, as verified by 16.5 % SDS-PAGE. The recombinant peptide PsDef2 showed activity against phytopathogenic Fusarium sporotrichiela fungus and Phythophtora gonapodyides oomycete at 5 µM concentration. The availability of recombinant PsDef2 gives an option not only to examine its antimicrobial properties but to study its structure by spectroscopic methods (circular dichroism, NMR) in order to esta­blish relationships between the structure and function of pine defensins