Pharmacogénétique des médicaments thiopuriniques (implication des enzymes TPMT et IMPDH2 et de la RhoGTPase RAC1)

The thiopurine drugs, azathioprine, 6-mercaptopurine and 6-thioguanine, have been used for decades for their cytotoxic and immunosuppressive properties in the treatment of leukemias, chronic inflammatory or autoimmune diseases and in the prevention of allograft rejection. However, some patients treated with conventional doses of these molecules develop very severe side effects. The deficient activity of the thiopurine S-methyltransferase (TPMT), an enzyme involved in thiopurine inactivation, is one of the key factors in the myelotoxicity of these drugs. The determination of the TPMT phenotype by genotyping test is a preventive measure before the initiation of thiopurine therapy and is based on the identification of the most common inactivating mutations of the TPMT gene. First, our study consisted in the functional analysis of four new allelic variants of TPMT, using an heterologous expression system, the yeast S. cerevisiae. The non-functional character of two of those variants was demonstrated. However, TPMT deficiency explain only about 30 % of cases of thiopurine myelotoxicity, suggesting the existence of other genetic abnormalities affecting other genes involved in the response toward thiopurines. Accordingly, we studied the genetic polymorphism of two other proteins, the inosine monophosphate dehydrogenase type 2 (IMPDH2), a key enzyme in the production of the active metabolites of thiopurine, and the RhoGTPase RAC1, which is one of the pharmacological targets of these molecules. Some of the polymorphisms that we identified in those two genes seem to affect in vitro the expression and / or activity of these proteins and, therefore, could contribute to inter-individual variations of the response to thiopurine.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF

Etude du polymorphisme génétique de la mercaptopyruvate sulfurtransférase (MPST) et de la thiosulfate sulfurtransférase (TST ou rhodanèse), enzymes impliquées dans la détoxication des cyanures chez l'homme

La Mercaptopyruvate Sulfurtransférase (MPST) et la Thiosulfate Sulfurtransférase (TST) sont deux enzymes jouant un rôle central dans la détoxification des cyanures. Un défaut d'activité, d'origine génétique, de ces enzymes pourrait être à l'origine de variations interindividuelles de susceptibilité à la toxicité des cyanures et être impliqué dans la genèse et/ou l'évolution de maladies héréditaires. Notre travail a consisté à évaluer la nature et l'étendue de la variabilité de la séquence nucléotidique des gènes de ces deux enzymes dans une population d'individus sains et de patients atteints de deux pathologies intestinales à composante environnementale et génétique, à l'aide d'une stratégie basée sur le couplage de l'analyse du polymorphisme de conformation de fragments d'ADN simple brin générés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR-SSCP) et du séquençage. Ce travail nous a permis d'identifier de nombreux variants de ces gènes. L'étude in vitro et in vivo des conséquences fonctionnelles de ces variants sur l'expression des gènes et l'activité des enzymes codées a ensuite été effectuée. Les résultats de ce travail démontrent pour la première fois l'existence d'un polymorphisme génétique fonctionnel de la MPST et de la TST. Les conséquences cliniques de ces polymorphismes restent à démonter.The Mercaptopyruvate Sulfurtransférase (MPST) and the Thiosulfate Sulfurtransférase (TST) are both key enzymes in cyanide detoxification. A deficiency of genetic origin in MPST or TST activity would lead to interindividual variability in susceptibility to cyanide and, consequently, could be involved in the pathogenesis of environmental diseases (ulcerative colitis and Crohn disease). The present work consisted first in the mutational screening of the MPST and TST genes in DNA samples from large groups of healthy individuals and patients, using a PCR-SSCP strategy and sequencing. This strategy allowed us to identify numerous polymorphisms in both genes. The functional consequences of some of the identified polymorphisms were then assessed by in vitro and in vivo assays. Our findings revealed for the first time the existence of a functional genetic polymorphism of MPST and TST. The clinical relevance of these genetic polymorphisms remains to be analysed.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Stratégies analytiques en toxicologie d'urgence

La Toxicologie d'urgence associe la notion d'exploration d'un très vaste domaine de substances chimiques à la notion d'efficacité de prise en charge thérapeutique du sujet intoxiqué. En conséquence, la stratégie analytique à adopter sera le fruit d'une collaboration clinico-biologique étroite comprenant l'approche clinique (anamnèse, signes cliniques), l'approche biologique (gazométrie, osmolalité, ionogramme, ...) et la connaissance des limites et des intérêts des différentes méthodes disponibles localement. Les méthodes spectrophotométriques et immunologiques sont des méthodes de dépistage au champ d'application limité et dont l'intérêt est d'apporter rapidement une orientation sur l'origine de l'intoxication (pesticides, médicaments, substances illicites, ...). Les méthodes séparatives associées à des outils de détection (spectres UV, spectres de masse) sont le complément indispensable à l'identification des molécules responsables de l'intoxication. En dernière étape, l'analyse quantitative du produit toxique identifié peut faire appel à une méthode immunologique (paracetamol, digoxine, ...) ou chromatographique (méprobamate, colchicine, ...)

Détermination de la concentration sérique du formiate et du glycolate par spectroscopie RMN

L'absorption massive volontaire ou accidentelle d'alcools ou de glycols demande une prise en charge thérapeutique rapide et bien adaptée. Dans la plupart des cas, le diagnostic à l'hospitalisation fait appel à des signes cliniques et biologiques. Le dosage plasmatique simultané du methanol et de l'éthylène glycol est aussi réalisable mais il est exceptionnel de mesurer deux metabolites toxiques intéressants : l'acide formique, metabolite du methanol, et l'acide glycolique, pour l'éthylène glycol. Or, l'intérêt diagnostique de ces deux paramètres est essentiel, en particulier lorsque l'intoxication est découverte tardivement. Par spectroscopic RMN 1H, les anions formiate et glycolate présentent deux singulets caractéristiques à 8,44 et 3,93 ppm, correspondant respectivement à leurs groupements fonctionnels méthine et méthylène. Dans ce travail, nous présentons la validation de la quantification du formiate et du glycolate par RMN 1H. La linéarité (de 0 à 40 mmol/l) et la répétabilité (c.v. = 6,7 %) ont été déterminées. Puis l'analyse a porté sur 40 échantillons de sérum supplémentés. Des composés potentiellement interférents (alcools, diols, polyols, acides), ajoutés aux sérums, n'ont pas perturbé la quantification. L'apport de la RMN 1H à ce type de diagnostic est discuté

Technique d'extraction de 12 benzodiazépines dans le plasma. Résultats expérimentaux multicentriques

Dans le cadre des différents thèmes de travail proposés aux membres de la commission de Toxicologie Clinique de la SFTA, une étude est réalisée sur l'identification et la quantification simultanée de 12 benzodiazépines dans le plasma. L'objectif est de tester la robustesse d'une technique d'extraction en l'imposant aux différents participants, les conditions chromatographiques de séparation et le mode de détection restant libres, fonctions de l'équipement de chaque laboratoire. L'étude a été réalisée sur une période de 2 mois et demi. Deux échantillons tests de plasmas surchargés avec 12 benzodiazépines à des concentrations thérapeutiques ou supra-thérapeutiques sont adressés à chaque centre d'investigation en vue de leur évaluation. La technique d'extraction utilise un mélange d'hexane / dichlorométhane en milieu tamponné (pH 9.2) et le loflazépate d'éthyle comme standard interne. Une méthode CLHP avec détecteur à barrette de diode est proposée à défaut par le laboratoire coordonnateur aux participants ne disposant pas de technique d'analyse. Sur les 11 participants, 10 utilisent une technique CLHP, un seul une technique CPG. Parmi les techniques CLHP, 2 d'entre elles associent un détecteur de masse, 7 un détecteur à barrette de diodes, 1 un détecteur UV. La technique CPG est associée à un détecteur de masse. L'analyse des résultats montre que la technique d'extraction proposée a été testée avec succès par 8/11 des participants : 4/11 laboratoires sans erreur et 4/11 laboratoires avec 1 ou 2 résultats exclus. Par contre, 3/11 laboratoires ont rencontré des difficultés majeures : un site par la survenue d'émulsions lors du traitement des échantillons tests (plasmas lyophilisés à reconstituer), un site par manque de temps et d'expérience, le troisième mettant en cause le choix du standard interne en technique CPG, le loflazépate d'éthyle n'ayant pas fait l'objet d'une étude préalable par cette technique

Technique d'extraction de 12 benzodiazépines dans le plasma. Résultats expérimentaux multicentriques

peer reviewedDans le cadre des différents thèmes de travail proposés aux membres de la commission de Toxicologie Clinique de la SFTA, une étude est réalisée sur l'identification et la quantification simultanée de 12 benzodiazépines dans le plasma. L'objectif est de tester la robustesse d'une technique d'extraction en l'imposant aux différents participants, les conditions chromatographiques de séparation et le mode de détection restant libres, fonctions de l'équipement de chaque laboratoire. L'étude a été réalisée sur une période de 2 mois et demi. Deux échantillons tests de plasmas surchargés avec 12 benzodiazépines à des concentrations thérapeutiques ou supra-thérapeutiques sont adressés à chaque centre d'investigation en vue de leur évaluation. La technique d'extraction utilise un mélange d'hexane / dichlorométhane en milieu tamponné (pH 9.2) et le loflazépate d'éthyle comme standard interne. Une méthode CLHP avec détecteur à barrette de diode est proposée à défaut par le laboratoire coordonnateur aux participants ne disposant pas de technique d'analyse. Sur les 11 participants, 10 utilisent une technique CLHP, un seul une technique CPG. Parmi les techniques CLHP, 2 d'entre elles associent un détecteur de masse, 7 un détecteur à barrette de diodes, 1 un détecteur UV. La technique CPG est associée à un détecteur de masse. L'analyse des résultats montre que la technique d'extraction proposée a été testée avec succès par 8/11 des participants : 4/11 laboratoires sans erreur et 4/11 laboratoires avec 1 ou 2 résultats exclus. Par contre, 3/11 laboratoires ont rencontré des difficultés majeures : un site par la survenue d'émulsions lors du traitement des échantillons tests (plasmas lyophilisés à reconstituer), un site par manque de temps et d'expérience, le troisième mettant en cause le choix du standard interne en technique CPG, le loflazépate d'éthyle n'ayant pas fait l'objet d'une étude préalable par cette technique

Consommation d'une association cocaïne-atropine : étude par CPG/SM et spectroscopie RMN

Un cas d'intoxication par un mélange cocaïne atropine est rapporté chez un homme de 34 ans, retrouvé inanimé chez lui. Admis aux urgences, il présente des troubles de l'élocution et de la marche, des vertiges, une mydriase et une amnésie antérograde. L'analyse par CPG/SM de la poudre consommée a permis de mettre en évidence les deux composés majoritaires, cocaïne et atropine, ainsi que quelques traces de phénacétine. Le mélange ayant sûrement été fait succinctement, les différentes analyses quantitatives ont révélé l'hétérogénéité de composition avec en moyenne 60 % de cocaïne et 30 % d'atropine, confirmée par spectroscopie RMN 1H. Des échantillons d'urine et de sang ont été recueillis. Le sang a été analysé par CPG/SM : la cocaïne a été quantifiée à 1557 $\mu$g/L et son métabolite, la benzoylecgonine, à 725 $\mu$g/L. L'urine a été analysée par CPG/SM et spectroscopie RMN 1H : par CPG/SM, la cocaïne a été quantifiée à 5,5 mg/L, la benzoylecgonine à 38 mg/L et l'ecgonine méthylester (EME) à 8 mg/L. Par spectroscopie RMN 1H de l'urine, un pic de résonance à 2,90 ppm a été attribué aux groupes N-CH3 de la benzoylecgonine, de la cocaïne et de l'EME. Ce signal a été intégré à 180 $\mu$mol/L, ce qui est en accord avec les résultats de CPG/SM. La spectroscopie RMN 1H a permis d'identifier l'atropine par un pic à 2,70 ppm dû au groupe N-CH3 et par des signaux centrés sur 7,40 ppm dus à ses protons aromatiques. L'intégration des signaux de l'atropine a permis de la quantifier à 700 $\mu$mol/L. Dans l'urine, par spectroscopie RMN 1H, des perturbations métaboliques ont pu être observées : augmentation de la taurine (1,87 mmol/L ; 234 mg/L) et de l'histidine (0,69 mmol/L ; 107 mg/L), ce qui peut être mis en relation avec des effets connus de la cocaïne

Identification and functional analysis of two rare allelic variants of the thiopurine S-methyltransferase gene, TPMT*16 and TPMT*19.

Human thiopurine S-methyltransferase (TPMT) catalyses the S-methylation of thiopurine drugs. TPMT is genetically polymorphic and is associated with large interindividual variations in thiopurine drug toxicity and therapeutic efficacy. During routine genotyping of patients with Crohn's disease, one novel missense mutation, 365A>C (TPMT*19, Lys(122)Thr), and a recently described missense mutation, 488G>A (TPMT*16, Arg(163)His), were identified in a Caucasian and a Moroccan patient, respectively. Using a heterologous yeast expression system, kinetic parameters (K(m) and V(max)) of the two variants with respect to 6-thioguanine S-methylation were determined and compared with those obtained with the wild-type enzyme. The Lys(122)Thr exchange did not significantly decrease the intrinsic clearance value (V(max)/K(m)) of the variant enzyme. In contrast, the Arg(163)His substitution significantly decreased the intrinsic clearance value by three-fold. The Arg(163) is located in a highly conserved region of the human TPMT protein and, as such, the Arg(163)His substitution is expected to result in a marked reduction of enzyme activity, as confirmed by the in vitro data. Phenotyping by measurement of red blood cell TPMT activity indicated that the patient heterozygous for the Lys(122)Thr mutation had normal TPMT activity, whereas the patient heterozygous for the Arg(163)His mutation was an intermediate methylator, which demonstrated a positive correlation between TPMT phenotyping and the in vitro data. The identification of a novel non-functional allele of the TPMT gene improves our knowledge of the genetic basis of interindividual variability in TPMT activity. These data further enhance the efficiency of genotyping methods to predict patients at risk of an inadequate response to thiopurine therapy

Intoxications au dextropropoxyphène et au tramadol: bilan d'un an de recueil

La prescription de plus en plus fréquente du dextropropoxyphène (DP) et du tramadol, deux antalgiques opioïdes, a conduit les membres du groupe de travail "Toxicologie hospitalière" de la Société Française de Toxicologie Analytique (SFTA) à étudier leur toxicité clinique observée. L'étude a consisté en l'analyse des cas où l'une ou l'autre de ces molécules a été identifiée au décours d'un screening toxicologique réalisé durant l'année 2004 dans les laboratoires hospitaliers des membres de ce groupe. Pour chaque patient ont été recueillis les données démographiques, les concentrations plasmatiques en dextropropoxyphène, norpropoxyphène (NP) ou tramadol, la concentration plasmatique en paracétamol, les médicaments associés et les signes cliniques (digestifs, respiratoires, cardiaques et neurologiques). Aucune relation entre les concentrations plasmatiques de dextropropoxyphène et de paracétamol, ni entre celles de dextropropoxyphène ou de tramadol et la gravité clinique n'a été observée. Les concentrations plasmatiques observées en dextropropoxyphène sont faibles mais doivent attirer l'attention sur une éventuelle intoxication au paracétamol. Les concentrations plasmatiques en tramadol peuvent être élevées mais les intoxications sont dans l'ensemble peu sévères et les concentrations toxiques semblent très supérieures à la concentration de 1 mg/L