Desarrollo de una nueva herramienta diagnóstica para redefinir la firma molecular de la receptividad endometrial

Motivación: La implantación embrionaria es un proceso que tiene lugar durante un breve periodo de tiempo donde el tejido endometrial alcanza un estado receptivo y donde se expresan moléculas que son necesarias para el proceso de implantación y posterior invasión del embrión. Este periodo se conoce como ventana de implantación y tiene lugar alrededor del día 20-21 del ciclo menstrual. El endometrio receptivo ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista histológico y molecular, y se conocen gran número de marcadores que forman parte de la firma molecular del endometrio receptivo, lo cual ha servido para desarrollar herramientas moleculares genómicas para el diagnóstico de la receptividad endometrial con utilidad clínica. Sin embargo, hasta ahora no se ha tenido en cuenta que la capacidad receptiva del endometrio tiene un componente inmunológico importante que facilita la entrada del tejido embrionario en el tejido materno. Este estudio pretende caracterizar el endometrio a nivel molecular, teniendo en cuenta tanto factores necesarios para la receptividad endometrial como para el control de la respuesta inmunológica.Métodos: 1 y 2. Selección de los marcadores de receptividad endometrial y respuesta inmunitaria tras revisión bibliográfica exhaustiva. Se seleccionaron 192 marcadores moleculares. 3. Diseño de los oligonucleótidos para la realización del test, compatibles con la novedosa plataforma Fluidigm, las cuales están siendo validadas en la Universidad para el posterior estudio de expresión. 4. Estudio prospectivo de la expresión de dichos marcadores en muestras las humanas que desde el principio del proyecto se han estado recogiendo. 5. Análisis de los datos obtenidos.Resultados: De momento se están validando las sondas de oligonucleótidos diseñadas para el Fluidigm. Una vez acabado este paso se iniciará el estudio con las muestras tomadas. Lo que esperamos es determinar los mejores marcadores para la receptividad endometrial, incluyendo algunos nuevos, y que el Fluidigm funcione como nueva plataforma para el desarrollo de la nueva herramienta diagnóstica de la receptividad endometrial en la que estamos trabajando.Conclusiones: La mejor y más exhaustiva caracterización del proceso de receptividad endometrial permitirá un mayor éxito en los tratamientos de fertilidad a los que se ven sometidas cada vez más parejas, y el uso del Fluidigm, además, redundará en una disminución de los costes económicos y el trabajo del investigador

Evaluación de la calidad seminal en pilotos de vuelos internacionales transoceánicos

Motivación: El factor masculino en reproducción está presente en la mitad de los casos de infertilidad, un problema de salud pública en auge en las ultimas décadas. Muchos estudios han demostrado que la calidad seminal se ha visto afectada por los contaminantes ambientales y los cambios en el estilo de vida, que pueden inducir procesos de fragmentación del DNA espermático o inducir estrés oxidativo(1). El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la calidad seminal de un grupo concreto, los pilotos de vuelos transoceánicos que, por su profesión, pueden suponer un grupo de riesgo de problemas de fertilidad debido a sus condiciones laborales. Los cambios constantes de presión, temperatura y estación, pueden ocasionar daños a nivel celular con afectación del DNA, que implique procesos de fragmentación masiva y, consecuentemente, una disminución o pérdida de la fertilidad con el subsecuente fracaso en el embarazo. Este trabajo también pretende poner de manifiesto la necesidad de un seminograma avanzado, mas allá de los parámetros básicos analizados convencionalmente.Métodos:Se llevó a cabo un seminograma estándar para evaluar concentración, volumen, motilidad, morfología y vitalidad, con ayuda de sistemas informáticos (SCA) para los ensayos de concentración y motilidad, microscopía tanto de campo claro como de fluorescencia, así como el kit Vitaltest para el ensayo de vitalidad.Para el análisis de fragmentación de DNA se realizaron 2 ensayos: el SCD (Sperm Chromatin Dispersion) para evaluar la fragmentación total (2) y el ensayo COMET, el cual identifica específicamente las roturas de cadena doble(3). Ambos se realizaron mediante la utilización de kits comerciales (Halotech DNA) y microscopía de fluorescencia para su recuento.Asimismo se realizó un ensayo para medir el estrés oxidativo, también mediante el uso de un kit comercial para un análisis colorimétrico (Halotech DNA).Conclusiones: A pesar de no tener aún los resultados necesarios, hay muchos estudios que demuestran que la calidad seminal, sobre todo respecto al DNA, se ve afectada por múltiples factores, ya sean ambientales, genéticos o referentes al estilo de vida, por lo que cabe esperar que este grupo concreto se vea afectado negativamente debido a sus condiciones laborales. Cada vez van surgiendo mas casos en los que el DNA espermático está tan dañado, que el ovocito es incapaz de reparar ese daño, con lo que se justifica el uso de un seminograma avanzado que estudie el material genético

Análisis de la expresión de marcadores tumorales en muestras de tumores humanos

Motivación: Los últimos datos de la OMS muestran una incidencia de 14,1 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en el mundo, siendo el cáncer de pulmón el principal causante de muerte por cáncer en hombres y el cáncer de mama en mujeres (1). En la actualidad existen varios test genómicos que han identificado huellas genómicas de tipos específicos de cáncer como Ampliseq, Oncotype Dx o MammaPrint, pero sólo unos pocos incluyen datos clínicos a parte de los genéticos. El análisis de expresión de los marcadores que forman dichos test permiten predecir la evolución del tumor o la respuesta a tratamiento (2). El objetivo del proyecto es generar un test genómico basado en una huella genómica de cáncer de mama de 40 genes y otro basado en una huella de 36 genes de adenocarcinoma de pulmón. Estos test permitirán estratificar a los pacientes en tres grupos de riesgo y predecir la supervivencia de los mismos (3). En paralelo pretendemos analizar la expresión de genes que codifican bombas de detoxificación implicadas en la resistencia a quimioterapia (MDR, multidrug resistance).Métodos: De los 75 genes incluidos en el análisis de expresión se seleccionaron por un lado 32 genes de cáncer de mama, 30 genes de adenocarcinoma de pulmón y 6 genes de expresión constitutiva usados en los test genómico-clínicos patentados de Dueñas y col. (3); por otro lado, se hizo una revisión bibliográfica para seleccionar genes de transportadores ABC. A partir de ADNc de las biopsias y los primers diseñados se analizará la expresión de los marcadores en una plataforma BioMark 96.96 IFC Dynamic Array (Fluidigm). Esta plataforma es barata, sencilla y permite analizar la expresión de hasta 96 genes de forma simultánea mediante PCR cuantitativa.Resultados: De momento hemos diseñado los primers para todos los marcadores y hemos amplificado mediante PCR estándar 65 de los 75 marcadores. A continuación, los productos de PCR serán secuenciados para confirmar que corresponden a los marcadores y se analizará su expresión en cada muestra tumoral mediante PCR cuantitativa.Conclusiones: El análisis estadístico de los datos de qRT-PCR de las muestras de tumores humanos permitirá conocer que genes se encuentran sobre-expresados y cuales reprimidos en cada tumor; pudiendo predecir la evolución de la enfermedad en cada paciente y diseñar protocolos de quimioterapia más eficientes, acercándonos a la medicina personalizada