Hepatitis C virus translation and cell cycle

The 5' nontranslated region (NTR) of hepatitis C virus (HCV) contains highly structured segments which form internal ribosome entry site (IRES). This cis-active RNA element direct the cap-independent initiation of translation of the viral polyprotein in association with trans-acting cellular proteins. Thus HCV IRES plays a key role in the replication of virus, especially in liver in which various cellular proteins changes in their expression levels under the condition of chronic hepatitis. To construct a system in which HCV IRES activity could be continuously monitored in vivo, 2 stably transformed cell lines from Huh-7 cells (human hepatocellular carcinoma cells) that express a reporter protein (firefly luciferase) under the translational control of the IRES were established. The activity of the HCV IRES varies in different phases of the cell cycle and HCV IRES activity is highest during the mitotic (G2/M) phases of the cell cycle and lower in the quiescent (G0) phases. The gene expression dynamics of host factors and kinetics of HCV IRES activity in cells at various points during the cell cycle were evaluated using a cDNA microarray. HCV TRES activity correlated with a gene cluster induced in S and G2/M phases. Interestingly, most initiation factors known to bind or interact with HCV IRES (PCBP2, PTB, eIF3, eIF2 gamma, eIF2 beta, La protein and RNLPL) were induced during S and G2/M phases. Of these factors, the expression of La protein, PTB and eIF3 (p116, 170) were predominantly repressed in quiescent (G0) and induced in S and G2/M phases. Suppression or overexpression of La protein and PTB in cells significantly changed HCV IRES activity. In the livers of patients with chronic hepatitis C, the expression of La protein was significantly increased and correlated with the amount of HCV-RNA. Collectively, these data indicated that HCV utilizes host factors induced during cell division but not during quiescence for replication. Of these, La protein is a potent regulator and enhances HCV replication in regenerating hepatocytes in patients with chronic hepatitis C.Biomedical Reviews 2004; 15: 37-46

C型肝炎ウイルスの蛋白翻訳開始機構に関する検討

金沢大学附属病院C型肝炎ウイルス(以下HCV)は一本鎖のプラス鎖RNAウイルスであり、その5\u27末端非翻訳領域(5\u27NTR)にはウイルス蛋白翻訳機能を有するInternal ribosomal entry site(IRES)が存在する。このIRES依存性蛋白翻訳機能を生理的条件下で検討するため、我々はまず、真核生物の発現プロモーターとして汎用されているサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターの下流にRenilla luciferase(R-luci),HCVの5\u27NTR,Firefly lucifersase(F-luci)の順で遺伝子を組み込んだベクターを作成し、この遺伝子をHuh-7細胞に導入し、安定に発現している細胞(RCF-1、RCF-26)を樹立した。この樹立細胞を用いて、通常の真核生物の蛋白翻訳機能(キャップ依存性)とHCVのIRESによる蛋白翻訳機能(IRES依存性)を比較した。サイクロヘキサミド処理では、それぞれの蛋白翻訳機能は同様に低下した。ポリオウイスル感染では、キャップ依存性の蛋白翻訳能は低下し、IRES非依存性の蛋白翻訳の上昇が認められた。細胞周期を同期させ蛋白翻訳能を検討すると、HCVのIRES非依存性蛋白翻訳能は細胞の分裂期(M)で高く、休止期で(G0)低く制御され、細胞周期依存性の変化が認められた。以上よりHCVの蛋白翻訳能は細胞周期と密接に関わっており、ウイルス複製と肝炎における細胞死、再生との関連が示唆された。研究課題/領域番号:10770226, 研究期間(年度):1998 – 1999出典：「C型肝炎ウイルスの蛋白翻訳開始機構に関する検討」研究成果報告書　課題番号10770226（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10770226/)を加工して作

Molecular mechanisms of hepatocarcinogenesis in chronic hepatitis C virus infection

金沢大学医薬保健研究域医学系Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of hepatocellular carcinoma (HCC) and chronic liver disease worldwide. Recent developments and advances in HCV replication systems in vitro and in vivo, transgenic animal models, and gene expression profiling approaches have provided novel insights into the mechanisms of HCV replication. They have also helped elucidate host cellular responses, including activated/inactivated signaling pathways, and the relationship between innate immune responses by HCV infection and host genetic traits. However, the mechanisms of hepatocyte malignant transformation induced by HCV infection are still largely unclear, most likely due to the heterogeneity of molecular paths leading to HCC development in each individual. In this review, we summarize recent advances in knowledge about the mechanisms of hepatocarcinogenesis induced by HCV infection. © 2011 Journal of Gastroenterology and Hepatology Foundation and Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

C型肝炎ウイルス増殖に関わる宿主因子の同定

我々はこれまでに、樹立細胞システム(RCF-26)を用いて、HCV-IRES活性は細胞密度が低い状態でより活性化され、細胞密度が高い状態では抑制されること、細胞周期との関連において、HCV-IRES活性は細胞の分裂期(M期)で高く、休止期(G0)で低いことを明らかにした(Honda et al.,118:152-162,2000,Gastroenterology)。HCV-IRES活性に如何なる宿主因子が関与しているか明らかにするため、まず、真核生物の各種翻訳開始因子とHCV-IRES活性を制御すると考えられる宿主因子(eIF2,eIF3,eIF4A, eIF4E, eIF4G, PTB, Laなど)を可能な限り選出し、それらの遺伝子を含んだ新しいcDNAチップを作成し、各細胞周期における遺伝子発現とHCV-IRES活性を検討した。興味深いことに、それら翻訳関連因子の発現はそれぞれS期、G2/M期、G1期に発現する遺伝子群に群別され、HCV-IRESとの関連が報告されているPCBP2,PTB, eIF3,eIF2gamma, eIF2 beta, La protein, RNLPLはS期及びG2M期に発現誘導されていた。一方、キャップ依存性蛋白翻訳に於いてのみ必要とされるeIF4A、eIF4BはG1期で発現上昇しており、HCV-IRES活性とreciprocalな変動を示した。各翻訳関連因子の発現量がHCV-IRES活性にどの程度影響を与えるかについて、それぞれの翻訳因子に対するantisense oligoを作成し、各因子の発現を抑制して、HCV-IRES活性を検討したところ、La蛋白、PTBの発現抑制によりHCV-IRES活性の有意な低下が認められた。さらに、各宿主因子の発現ベクターを構築しRCF-26で過剰発現させHCV-IRES活性を検討すると、La蛋白、PTB、eIF3の過剰発現によりHCV-IRES活性の上昇が認められた。In vitro translationの系を用いてLa蛋白、PTB、eIF3とHCV-IRESをco-translationしLa蛋白、PTB、eIF3蛋白のHCV-IRES活性に与える影響について検討すると、La蛋白、PTB、eIF3は容量依存性にHCV-IRES活性を上昇させたが、Encephalomyocarditis virus (EMCV)-IRESには殆ど影響を与えなかった。従ってHCV-IRES活性はより宿主因子に依存していることが明らかとなった。実際の肝組織でLa蛋白、PTB、eIF3の発現をReal time RT-PCRを用いて検討すると、C型慢性肝炎肝組織においてLa蛋白が正常例より有意に発現亢進していた。さらにLa蛋白の発現が高いほど肝組織でのHCV-RNA量が多かった。実際の肝組織に於いてもLa蛋白がHCVの複製に重要な働きをしていることが明らかとなった。Background and aim : Translation of hepatitis C virus(HCV) is an essential step of the viral replication and is mediated by an internal ribosome entry site(IRES). We previously reported that HCV-IRES is most active during the synthetic(S) or mitotic(M) phases and lowest during the quiescent(G0) phases. Here we investigated responsible host factors that regulate HCV-IRES. Methods : We synchronized the cell cycle progression of RCF-26,that constitutively express dicistronic RNA transcripts containing two reporter genes separated by a functional HCV-IRES. Then we evaluated dynamism of genes expression of host factors and kinetics of HCV-IRES activity in cells at various points during the cell cycle using a CDNA microarray. We also validated a significance of identified host factors on HCV replication in vivo. Results : HCV-IRES activity correlated with a gene cluster induced in S and G2/M phases. Interestingly, most of initiation factors that bind or interact with HCV-IRES(PCBP2,PTB,eIF3,eIF2gamma,eIF2 beta, La protein and RNLPL) were induced during the S and G2/M phases. Especially, expressions of La protein, PTB and eBR3(p116,170) were predominantly repressed in quiescent(G0) and induced in S and G2/M phases. The suppression or overexpression of La protein, PTB and eIF3(p170) in RCF-26 significantly changed HCV-IRES activity. In the livers of patients with chronic hepatitis C, the expression of La protein was significantly increased and correlated with the amount of HCV-RNA. Conclusions : The translation of HCV is regulated by cellular proteins that vary in abundance during the cell cycle. Of these, La protein is a potent regulator and would enhance HCV replication in regenerating hepatocytes in patients with chronic hepatitis C.研究課題/領域番号:14570410, 研究期間(年度):2002-200

C型肝炎ウイルス増殖に関わる宿主因子の同定とその肝病態における役割

これまでにHCV-IRES発現細胞RCF-26を用いてHCV-IRES関連因子の中でLa,PTB,eIF2 gamma,PSMA7がHCV-IRES活性に重要な働きを有していることを示した。本研究ではHCVレプリコンを用いて、これらの翻訳因子がHCVの複製に与える影響を検討した。siRNAを用いて各翻訳因子の発現を特異的に抑制した場合、EMCV-IRESを有する従来型HCVレプリコン(NNeowt)の複製は抑制されなかったが、HCV-IRESのみを有する新たに構築したHCVレプリコン(MH14C)の複製は著明に抑制された。従ってこれらの翻訳因子の抑制はHCV-IRES活性の低下を介して、HCVの複製を抑制したものと考えられる。興味深いことに、実際のC型慢性肝炎肝組織におけるこれらの翻訳因子の発現とHCVの複製との関連を検討すると、La,eIF2 gamma,PSMA,PCBP2の発現が、肝組織内のHCV-RNAと有意に相関することが明らかになった。マイクロアレイを用いた正常肝18例、C型慢性肝炎肝組織37例の肝組織遺伝子発現プロファイル解析ではこれらの遺伝子はC型慢性肝炎肝組織で誘導される一群の遺伝子クラスターに群別された。さらにLaの発現制御を検討すると、LaはHCVタンパク自身の発現によって誘導されることが明らかとなった。Laプロモーター領域をクローニングし、ルシフェラーゼ・レポーターアッセイにて検討すると、HCVのあるタンパクが、Laプロモーターを活性化していることが明らかとなった。以上より、Laは細胞周期亢進によっても誘導されるほか、HCV感染そのものによっても誘導されることが明らかとなった。Background and aim : Translation of the hepatitis C virus (HCV) is mediated by an internal ribosome entry site (IRES). Many translation initiation factors interact with HCV IRES; however, the functional relevance of these factors for the translation and replication of HCV has not been clarified. Methods : Two different subgenomic HCV replicons, NNeo/3-5B and MH14C, were used. NNeo/3-5B consists of an HCV replicon with a standard structure in which NS3-NS5 was translated by encephalomyocarditis (EMCV) IRES. MH14C is an HCV replicon with a modified structure in which EMCV IRES was replaced with HCV IRES. Of 14 translation initiation factors suppressed by antisense oligodeoxynucleotides or siRNA, La protein, PTB, eIF3 p170, eIF2 gamma, and PSMA 7 affected HCV IRES activity and the replication of MH14C. However, these factors did not affect EMCV IRES activity and the replication of NNeo/3-5B. La protein, eIF2 gamma, and PSMA7 were significantly correlated with HCV RNA in the liver of 37 patients with chronic hepatitis C (CH-C). Gene expression profiling using a cDNA microarray revealed these initiation factors were induced in CH-C and clustered in a group of genes representing inflammation, DNA repair and stress responses. One of the HCV coding proteins, NS5A, activated the La protein promoter and the interferon sensitivity-determining region in NS5A was responsible for the activation. Conclusions: HCV replication was highly dependent on translation initiation factors that were induced in tissue lesions of CH-C. The induction of La protein by the HCV protein NS5A might support the replication and persistent infection of HCV.研究課題/領域番号:17591036, 研究期間(年度):2005-200

5症例より得られたC型肝炎ウイルスの構造遺伝子解析と,その多様性について

取得学位 : 博士（医学）, 学位授与番号 : 医博甲第1023号,学位授与年月日：平成4年3月25日,学位授与年：199

インターフェロンによるC型肝炎ウイルス蛋白翻訳抑制機構の解明

金沢大学医薬保健研究域医学系我々は、先にサイトメガロウイルスプロモーターの下流にRenilla luciferase(R-luci), HCVの5\u27NTR, Firefly luciferasc(F-luci)の順で遺伝子を組み込んだベクターを作成し、この遺伝子を恒常的に発現しているHuh-7由来細胞を樹立した。この樹立細胞では、R-luciは通常の真核生物の蛋白翻訳機構であるキャップ依存性に、F-luciはHCVの5\u27NTRによりIRES依存性に翻訳される。この樹立細胞を用いた検討でHCVの蛋白翻訳効率は細胞分裂期で高いことを見いだしている(Gastroenterology118, 152-162, 2000)。今回、インターフェロン及び二本鎖RNA(Poly I : Poly C)処理によりIRES依存性蛋白翻訳が特異的に抑制されることを見いだした。この作用メカニズムを解明するため、インターフェロンによる、2-5AS(oligoadenylate synthetase)活性の誘導、PKR(2本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ)の活性化、及びHCV-IRESを活性化させる宿主蛋白であるLa protein、及びPyrimidine tract binding protein(PTB)の発現を検討した。インターフェロンの投与により2-5ASは著名に上昇したが、Poly I : Poly C投与では活性の上昇は顕著でなかった。PKRの発現はインターフェロン、Poly I : Poly C投与で上昇したが、トランスフェクションによるPKR発現過剰状態ではIRES活性の特異的抑制は見られなかった。一方、IRES活性化因子のLa proteinはインターフェロン、Poly I : Poly C投与で発現が著名に抑制され、PTB及びコントロールとして用いたアルブミンの発現には変化が認められなかった。また、La proteinの過剰発現により、インターフェロン、Poly I : PolyCによる特異的IRES活性抑制は消失した。以上より、La proteinの発現がインターフェロンの抗ウイルス活性に影響を与えていることが明らかとなった(Hepatology35, 199-208, 2002)研究課題/領域番号:12770254, 研究期間(年度):2000-2001出典：「インターフェロンによるC型肝炎ウイルス蛋白翻訳抑制機構の解明」研究成果報告書　課題番号 12770254（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12770254/)を加工して作

Gene Systems Network Inferred from Expression Profiles in Hepatocellular Carcinogenesis by Graphical Gaussian Model

Hepatocellular carcinoma (HCC) in a liver with advanced-stage chronic hepatitis C (CHC) is induced by hepatitis C virus, which chronically infects about 170 million people worldwide. To elucidate the associations between gene groups in hepatocellular carcinogenesis, we analyzed the profiles of the genes characteristically expressed in the CHC and HCC cell stages by a statistical method for inferring the network between gene systems based on the graphical Gaussian model. A systematic evaluation of the inferred network in terms of the biological knowledge revealed that the inferred network was strongly involved in the known gene-gene interactions with high significance (P<10−4), and that the clusters characterized by different cancer-related responses were associated with those of the gene groups related to metabolic pathways and morphological events. Although some relationships in the network remain to be interpreted, the analyses revealed a snapshot of the orchestrated expression of cancer-related groups and some pathways related with metabolisms and morphological events in hepatocellular carcinogenesis, and thus provide possible clues on the disease mechanism and insights that address the gap between molecular and clinical assessments

Molecular Mechanism Underlying the Suppression of CPB2 Expression Caused by Persistent Hepatitis C Virus RNA Replication

The mechanisms of hepatitis C virus (HCV)-associated hepatocarcinogenesis and disease progression are unclear. We previously observed that the expression level of carboxypeptidase B2 (CPB2) gene was remarkably suppressed by persistent HCV RNA replication in human hepatoma cell line Li23-derived cells. The results of the present study demonstrated that the CPB2 expression in patients with chronic hepatitis C was inversely correlated with several risk factors of hepatic fibrosis or steatosis, although ectopic CPB2 expression did not suppress the expression of fibrogenic or lipogenic genes. The suppressed CPB2 expression was restored by treatment with 5-azacytidine. To clarify the mechanism underlying this phenomenon, we analyzed the CPB2 promoter, and the results revealed that (1) hepatocyte nuclear factor 1 (HNF1), especially HNF1α, was essential for the CPB2 promoter, and (2) CPB2 promoter was not methylated by persistent HCV RNA replication. The expression levels of HNF1α and HNF1β were also not changed by persistent HCV RNA replication. These results suggest the existence of 5-azacytidine-inducible or -reducible unknown factor(s) that can control the CPB2 expression. To evaluate this idea we performed a microarray analysis, and several gene candidates corresponding to the suggested factor(s) were identified