Evolution of trappin genes in mammals

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Trappin is a multifunctional host-defense peptide that has antiproteolytic, antiinflammatory, and antimicrobial activities. The numbers and compositions of <it>trappin </it>paralogs vary among mammalian species: human and sheep have a single <it>trappin-2 </it>gene; mouse and rat have no <it>trappin </it>gene; pig and cow have multiple <it>trappin </it>genes; and guinea pig has a <it>trappin </it>gene and two other derivativegenes. Independent duplications of <it>trappin </it>genes in pig and cow were observed recently after the species were separated. To determine whether these <it>trappin </it>gene duplications are restricted only to certain mammalian lineages, we analyzed recently-developed genome databases for the presence of duplicate <it>trappin </it>genes.</p> <p>Results</p> <p>The database analyses revealed that: 1) duplicated <it>trappin </it>multigenes were found recently in the nine-banded armadillo; 2) duplicated two <it>trappin </it>genes had been found in the Afrotherian species (elephant, tenrec, and hyrax) since ancient days; 3) a single <it>trappin-2 </it>gene was found in various eutherians species; and 4) no typical <it>trappin </it>gene has been found in chicken, zebra finch, and opossum. Bayesian analysis estimated the date of the duplication of <it>trappin </it>genes in the Afrotheria, guinea pig, armadillo, cow, and pig to be 244, 35, 11, 13, and 3 million-years ago, respectively. The coding regions of <it>trappin </it>multigenes of almadillo, bovine, and pig evolved much faster than the noncoding exons, introns, and the flanking regions, showing that these genes have undergone accelerated evolution, and positive Darwinian selection was observed in pig-specific <it>trappin </it>paralogs.</p> <p>Conclusion</p> <p>These results suggest that trappin is an eutherian-specific molecule and eutherian genomes have the potential to form <it>trappin </it>multigenes.</p

リン酸化RNAポリメラーゼIIによるmRNAプロセシング過程の制御機構

金沢大学がん進展制御研究所RNAポリメラーゼII(RNAP II)最大サブユニットカルボキシル末端領域(CTD)は、RNAP IIによるRNA合成中にダイナミックなリン酸化を受けながら、RNAプロセシング因子の転写部位への集合・離散を制御するscaffoldとして機能している。私は、リン酸化CTDに特異的に結合する新規因子の同定と機能検索を通じ、転写とRNAプロセシングをカップルさせている分子機構にアプローチしている。これまでに、ヒト新規核蛋白質PCIF1、細胞周期調節因子プロリルイソメラーゼPin1など4種類のWWドメイン蛋白質をリン酸化CTD結合因子として独自に同定してきた。今年度は脊椎動物PCIF1の機能解析を中心に行い、以下の結果を得ることが出来た。(1)トリB細胞株DT40を用いたPCIF1遺伝子ノックアウトによる解析から、PCIF1の発現消失に伴いPin1の発現亢進が観察された。このことから両者の機能的な関連性、またはPCIF1がPin1発現の負の調節因子である可能性が示唆された。(2)ノックアウトDT40細胞と正常細胞を比較し、mRNA発現量が変化する遺伝子をディファレンシャルディスプレイによって検索し候補遺伝子を単離した。(3)ヒトPCIF1は細胞周期M期特異的にリン酸化を受ける。(4)CTD脱リン酸化酵素ヒトSCP1による試験管内CTD脱リン酸化反応は、PCIF1またはPin1によって強く抑制される。(5)ヒトPCIF1および酵母CTD脱リン酸化酵素Ssu72のヒトオルソローグ遺伝子産物のC-末端側に、TAP(タンデムアフィニティー精製)タグを融合させた蛋白質を発現誘導出来るヒト安定細胞株を樹立した。またTAPタグ精製法によって各々の因子を含む細胞内複合体の精製を行った。研究課題/領域番号:15030217, 研究期間(年度):2003-2004出典：「リン酸化RNAポリメラーゼIIによるmRNAプロセシング過程の制御機構」研究成果報告書　課題番号15030217（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15030217/)を加工して作

ヒト内在性レトロウイルスRTVL-Hファミリーのenv遺伝子の存在

取得学位 : 博士（医学）, 学位授与番号 : 医博乙第1216号,学位授与年月日：平成5年5月10日,学位授与年：199

転写装置とmRNAプロセシング装置のクロストーク機構の解析

金沢大学がん進展制御研究所転写やmRNAプロセシングといった核内事象を連携(カップル)させている分子機構を明らかにするアプローチとして、精製した二種類のリン酸化及び非リン酸化フォームのRNAポリメラーゼII(Pol II)のin vitroスプライシング反応に対する影響を解析した。その結果Pol II最大サブユニットのカルボキシル末端領域(CTD)が高度にリン酸化したPol IIはスプライシング反応を強く促進し、一方非リン酸化フォームPol IIは反応を逆に抑制することを見い出し(Hirose et al. Genes & Dev.1999)、Pol IIが、転写後のmRNAプロセシングにも直接的に機能しうることを生化学的にはじめて明らかにすることが出来た。更にPol IIが、CTDのリン酸化調節を介して、転写反応のみならずmRNAプロセシング等の他の核内事象に如何なる分子間相互作用を通じて関わっているかを明らかにするために、リン酸化CTDに結合する新規蛋白質の同定をFar-western法を用いた発現クローニングによって試みた。これまでの解析から、リン酸化CTDに結合する候補蛋白質としてヒトの新規蛋白質PCIF1(Phosphorylated CTD Interacting Factor 1)及び既知のヒト核蛋白質Pin1を同定した。これらの蛋白質のリン酸化CTDとの結合責任領域をFar-western法及びGST-pull down法で同定した。新規蛋白質PCIF1については、flag-PCIF1叉はGFP-PCIF1をトランスフェクトした細胞を用いた免疫共沈実験、及び細胞内局在解析実験より、内在性のリン酸化RNAポリメラーゼIIとPCIF1の細胞内における特異的会合を確認した(未発表データ)。研究課題/領域番号:11154209, 研究期間(年度):1999出典：「転写装置とmRNAプロセシング装置のクロストーク機構の解析」研究成果報告書　課題番号11154209（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11154209/)を加工して作

RNAポリメラーゼIIによるmRNAスプライシング調節機構の解析

金沢大学がん進展制御研究所転写やmRNAプロセシングといった核内事象を連携(カップル)させている分子機構を明らかにするアプローチとして、精製した二種類のリン酸化及び非リン酸化フォームのRNAポリメラーゼII(Pol II)のin vitroスプライシング反応に対する影響を解析した。その結果Pol II最大サブユニットのカルボキシル末端領域(CTD)が高度にリン酸化したPol IIはスプライシング反応を強く促進し、一方非リン酸化フォームPol IIは反応を逆に抑制することを見い出し(Hirose et al. Genes & Dev.1999)、Pol IIがmRNAプロセシング装置と物理的に相互作用出来るだけでなく、CTDのリン酸化調節を介してプロセシング反応を機能的に制御できる可能性を生化学的に示すことが出来た。更にPoll IIが、CTDのリン酸化調節を介して、転写反応のみならずmRNAプロセシング等の他の核内事象に如何なる分子間相互作用を通じて関わっているかを明らかにするために、リン酸化CTDに結合する新規蛋白質の同定をFar-western法を用いた発現クローニングによって試みた。これまでの解析から、リン酸化CTDに結合する候補蛋白質としてヒトの新規蛋白質PCIF1(Phosphorylated CTD Interacting Factor 1)及び既知のヒト核蛋白質Pin1を同定した。これらの蛋白質のリン酸化CTDとの結合責任領域をFar-western法及びGST-pull down法で同定した。新規蛋白質PCIF1については、flag-PCIF1叉はGFP-PCIF1をトランスフェクトした細胞を用いた免疫共沈実験、及び細胞内局在解析実験より、内在性のリン酸化RNAポリメラーゼIIとPCIF1の細胞内における特異的会合を確認した(未発表データ)。研究課題/領域番号:11155211, 研究期間(年度):1999出典：「RNAポリメラーゼIIによるmRNAスプライシング調節機構の解析」研究成果報告書　課題番号11155211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11155211/)を加工して作

アポトーシスにおけるスプライシング制御

金沢大学がん進展制御研究所アポトーシスと選択的スプライシング制御機構との関連を検索するために、アポトーシス誘導に応じたアポトーシス関連遺伝子のアイソフォーム発現パターンの変化、及びそれに附随したスプライシング制御システムの変化、とりわけRNAポリメラーゼII(PolII)最大サブユニットC-末端領域(CTD)のリン酸化状態の変化を解析した。HeLa及び293Tヒト培養細胞に、アポトーシス誘導刺激としてエトポシド添加またはUV照射処理を行い、それに附随した複数のスプライシングバリアントを持つことが知られているアポトーシス関連遺伝子(Bcl-x、Caspase 2、Caspase 9、Mcl-1、Apaf-1)のアイソフォーム発現パターンの変化をRT-PCRにより経時的に解析した。同時に、CTDのリン酸化状態の変動を、部位特異的なリン酸化を認識するモノクローナル抗体を用いウエスタンブロットによって検出した。更にスプライシング因子及びCTDをリン酸化することが報告されているMAPKの発現の変化をウエスタンブロットによって検討した。調べたアポトーシス関連遺伝子のアイソフォーム発現パターンは、今回検討したアポトーシス誘導刺激によっては大きな変動を示さなかった。一方ある線量以上の紫外線照射によってCTDリン酸化の量的・質的変動が観察され、更にPolII最大サブユニットの選択的な分解が観察された。一方エトポシド処理によってはPolIIの特異的分解は観察されなかった。現在、アポトーシス誘導時にApaf-1遺伝子のプロモーター近傍及び選択的スプライシングを受けるエクソン近傍で転写/プロセシングに関与している因子及びCTDのリン酸化状態の変化を、クロマチン免疫沈降法(ChIP)によって検索している。研究課題/領域番号:13216041, 研究期間(年度):2001出典：「アポトーシスにおけるスプライシング制御」研究成果報告書　課題番号13216041（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13216041/)を加工して作

RNAポリメラーゼIICTDリン酸化制御による転写とRNAプロセシングの協調機構

富山大学 / 金沢大学がん進展制御研究所RNAポリメラーゼII(Pol II)最大サブユニットカルボキシル末端領域(CTD)は、転写中にダイナミックなリン酸化-脱リン酸化調節を受けることによって、RNAプロセシング因子やヒストン修飾酵素の転写部位への集合を制御する足場として機能している。本研究は、脊椎動物細胞において転写とRNAプロセシング過程を協調的に制御している分子メカニズムを解明するために、CTDのリン酸化および構造変換を調節している因子である我々が近年同定した新規リン酸化CTD結合因子PCIF1、および酵母CTDフォスファターゼSsu72の脊椎動物オルソローグの機能を解析することを目的としている。本年度は昨年度に引き続き、それぞれの遺伝子のトリB細胞株DT40を用いたノックアウトによる解析を行い次のような結果を得た。(1)今回DT40野生株を出発細胞株としてトリPCIF1遺伝子ホモノックアウト細胞株を新たに樹立し解析を行った。その結果これまでに我々が観察していることと同様に、ノックアウト細胞においてはトリプロリルイソメラーゼPin1の発現が亢進していること、細胞へのUV照射によるリン酸化Pol II特異的な分解が促進することが観察された。(2)3種類の独立したSsu72遺伝子コンディショナルノックアウト細胞株を樹立した。これらの細胞株を用いた解析から、トリSsu72は細胞生育に必須の因子であること、またトリU4 snRNA遺伝子の3\u27末端生成に関与している可能性が示唆された。一方出芽酵母の場合とは異なり、Ssu72ノックアウトによって細胞全体のPol II-CTDのリン酸化の程度は大きく影響されなかった。このことからSsu72は、少なくともトリ培養細胞においては主要なCTD脱リン酸化酵素ではなく、Ssu72以外のCTD脱リン酸化酵素が細胞内で機能している可能性が示唆された。研究課題/領域番号:17026013, 研究期間(年度):2005 – 2006出典：「RNAポリメラーゼIICTDリン酸化制御による転写とRNAプロセシングの協調機構」研究成果報告書　課題番号17026013（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17026013/)を加工して作

アポトーシスにおけるスプライシング制御

金沢大学がん研究所アポトーシスの制御を司る遺伝子の多くは、選択的スプライシングによって作られる複数のアイソフォームを持ち、アイソフォームによって機能及び局在に多様性を持つことが知られている。とりわけBcl-xやCaspase-2,9,といった遺伝子は、選択的スプライシングによって作られる異なるアイソフォームが、一方はアポトーシス促進的に、他方はアポトーシス抑制的に機能することが知られている。細胞の生死を決める選択のなかで、選択的スプライシング制御システムがチェックポイント機構の一端を担っているのではないかと予想される。本研究は、アポトーシスのシグナル伝達機構と選択的スプライシング制御システムとの関連性を検索するために、アポトーシス誘導に附随した選択的スプライシング制御システムの変化を解析することを目的としている。とりわけ、近年mRNAプロセシング制御との関連が明らかになって来ているRNAポリメラーゼII(Pol II)最大サブユニットC-末端領域(CTD)のリン酸化状態を選択的スプライシング制御システムの指標として解析した。ヒト培養細胞に、アポトーシス誘導刺激として抗癌剤処理叉はUV照射処理を行い、それに附随した複数のスプライシングバリアントを持つことが知られているアポトーシス関連遺伝子(Bcl-x、Caspase 2、Caspase 9、Mcl-1、Apaf-1)のアイソフォーム発現パターンの変化を経時的にRT-PCRにより解析した。しかしこれらのアポトーシス関連遺伝子のアイソフォーム発現パターンに大きな変動は認められなかった。一方ある線量以上の紫外線照射処理によって、調べた幾つかのスプライシング因子の発現量に変化は観察されなかったにもかかわらず、Pol II-CTDの特定部位のリン酸化を受けたPol IIの量的変動及びPol IIの選択的な分解が観察された。研究課題/領域番号:12215050, 研究期間(年度):2000出典：研究課題「アポトーシスにおけるスプライシング制御」課題番号12215050（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12215050/）を加工して作