哺乳類細胞のHIヒストンリン酸化酵素の精製とその活性制御機構

金沢大学薬学部マウス倍養細胞FM3A細胞をもちいてH1ヒストン燐酸化酵素を、分裂期におけるH1ヒストン燐酸化部位を含む合成ペプチド(S1ペプチド)を基質に、核画分から硫安沈澱、MonoQ、ヒドロキシアパタイト、ス-パ-ロ-ス12、MonoSによって精製した。その結果、この酵素は酵母のCD2^+キナ-ゼの哺乳類型cdc2キナ-ゼと同一であることが免疫化学的手法により明らかになった。さらにこの酵素はH1ヒストンに対し非常に選択性が高く、各種ペプチド基質を用いた結果から、トレオニン(セリン)ープロリンー(アミノ酸)ーリジンの配列を認識することがわかった。H1ヒストン燐酸化酵素/cdc2キナ-ゼは細胞周期においてG2/M期で活性が上昇しこの活性の上昇は酵素の燐酸化チロシン残基の脱燐酸化を伴っているものと考えられた。しかもこのcdc2キナ-ゼのG2期での活性化、M期での不活性化いずれもフォスファタ-ゼ1、2Aの阻害剤オカダ酸によっておこることがわかり、活性化、不活性化いずれの制御機構においても蛋白質の燐酸化反応が関与しているものと考えられた。この機構の詳細については今後の研究が必要である。さらにG2/M期に高温で増殖が停止するマウス温度感受性変異株tsFT210細胞がcdc2キナ-ゼ遺伝子に点突然変異がおこりそれによりC末端部のプロリンがセリンに変化していることをが確認した。そのことから哺乳類細胞においてcdc2キナ-ゼがG2/M期に必須な酵素であることを明らかにした。The H1 histone kinase was purified from mouse mammary carcinoma cell line FM3A cells by use of several steps including ammonium sulfate precipitation, mono Q, hydroxylapatite, superose 12 and mono S coulumn chromatography. The-S1 peptide which contained the sequence of H1 histone phosphorylated at mitosis, was used as substrate. The purified enzyme was the same one as murine homolog to yeast CDC2^+ kinase. This was proven by immunological methods. This H1 histone/cdc2 kinase could phosphorylate specifically H1 histone and recognized Thr(Ser)-Pro-X-Lys sequence, that was proven by use of several synthetic peptides. The activity of H1 histone/cdc2 kinase was increased at G2/M phase and the activation was seemed to be regulated by the dephophorylation of the phosphorylated tyrosine residue of it. Furthermore, Okadaic acid, which was potent inhibitor of phophatase 1 and 2A, could activated the cdc2 kinase in vivo at G1/S and S phase, and it could inactivate same kinase in vivo at mitosis. This suggest that both activation and inactivation of this enzyme are requlated by the protein phosphorylation cascade. Next, it was proven that cdc2 kinase was necessary enzyme for the cells to enter mitosis by use of temperature sensitive mutant tsFT210 cells. The tsFT210 cells could grow at 33^ﾟC but could not grow at 390C. The cells were arrested at G2/M phase at 39^ﾟC.The activity of cdc2 kinase in vitro was temperature sensitive, compared to wild type enzyme. The the cDNA of cdc2 kinase was amplified by PCR method, and sequenced. One point mutation, C to T Change, was found in this mutant at the 905th base from the initial A in ATG codon. This mutation caused a change of proline to serine in the carboxyl teminal region of this enzyme. The wild type cDNA could compensate the temperature sensitivity of this mutant by the transfection into the mutant, it was clear that the mutant cells could not enter nitosis because of the defect of cdc2 kinase.研究課題/領域番号:01571200, 研究期間(年度):1989 – 1990出典：研究課題「哺乳類細胞のHIヒストンリン酸化酵素の精製とその活性制御機構」課題番号01571200（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-01571200/015712001990kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

染色体凝縮制御におけるcdc2キナ-ゼの役割

金沢大学薬学部cdc2キナ-ゼは哺乳類細胞において分裂期における染色体凝縮に重要な役割を果たしていると考えられている。今年度はこの染色体凝縮が高温でおこらないマウス温度感受性変異株tsFT210細胞の解析におこなった。この細胞は高温ではG2期の停止点をもち染色体凝縮がおこらなかった。cdc2キナ-ゼ活性を調べたところ、変異細胞の酵素は野生株の酵素に比べて温度感受性であった。そこでこの変異細胞のcdc2キナ-ゼcDNAをPCR法で増幅し、塩基配列を野生株のものと比較したところ開始コドンから905番目の塩基Cが変異細胞ではTに変化し、その結果アミノ酸のプロリンがセリンに変化していた。さらに野生株のcDNAを変異細胞に移入すると変異細胞の温度感受性が相補された。以上のことからこのtsFT210細胞はcdc2キナ-ゼが温度感受性であるためにG2期の高温で停止することが考えられ、cdc2キナ-ゼが分裂期における染色体凝縮に必須なものとの知見が得られた。さらにこのcdc2キナ-ゼ活性を制御している因子の検討をおこなった。分裂期でのcdc2キナ-ゼの活性化は燐酸化チロシン基の脱燐酸化によると考えられた。さらにcdc2キナ-ゼと結合するサイクリン蛋白質がこの酵素活性に影響を与えていると考えられ、結合するサイクリンの種類によってcdc2キナ-ゼを分離したところサイクリンA結合体とさいクリンB結達体でH1ヒストンに対する親和性が大きく違っていることが確認された。この基質に対する親和性の変化が細胞内におけるcdc2キナ-ゼの基質の変化に対応している可能性が高いと思われた。研究課題/領域番号:02260203, 研究期間(年度):1990出典：研究課題「染色体凝縮制御におけるcdc2キナ-ゼの役割」課題番号02260203（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-02260203/）を加工して作

DNA複製制御におけるサイクリン依存性キナーゼ(cdk)の役割

金沢大学薬学部分裂酵母のweel変異を相補できるヒトweel遺伝子産物を大腸菌内で発現精製し、その酵素活性を検討した。その結果ヒトweelキナーゼはサイクリンB/cdc2キナーゼのTyr-15を燐酸化しその活性を阻害することを明らかにした。しかしこの酵素はThr-14を燐酸化できなかった。このことはThr-14を燐酸化しp34^キナーゼ活性を阻害する新たなキナーゼが存在することを示唆している。一方、3種のヒトcdc25フォスファターゼを大腸菌内で発現させ、これら酵素の活性も検討した。前記したp34^キナーゼの燐酸化による活性阻害はこのヒトcdc25フォスファーターゼにより回復する。3種存在するヒトcdc25フォスファターゼのうち少なくともcdc25BはこのTyr-15のみならずThr-14の燐酸基も脱燐酸化し、その活性を上昇させる。さらにcdk2の活性制御に関連してこの酸素の燐酸化部位を検討したところTyr-15とThr-160が確認された。このThr-160が燐酸化されるとSDS電気泳動で移動度が速くなり、これは蛋白質、p34^キナーゼを含め、一般に、燐酸化されると移動度が遅くなる現象とは異なる。サイクリンA結合cdk2はこのThr-160の燐酸化体であったことから、サイクリン結合にはこのThr-160の燐酸化が必要であると考えられた。サイクリンA/cdk2のTyr-15の燐酸はヒトCDC25フォスファターゼではサイクリンB/cdc2キナーゼのようには効率よく脱燐酸化されず、この原因がサイクリン蛋白質の違いによるのかどうか、Tyr-15の生理的意味を含めて興味深い。研究課題/領域番号:04256211, 研究期間(年度):1992出典：研究課題「DNA複製制御におけるサイクリン依存性キナーゼ(cdk)の役割」課題番号04256211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04256211/）を加工して作

モノクローナル抗体をもちいた,HIヒストンのクロマチン構造の調節に関する研究

金沢大薬学部HIヒストンのクロマチン構造の調節における役割を研究する為に、HIヒストン小成分に対するモノクローナル抗体の作製を試みた。HIヒストン小成分の分離はラット肝から全HIヒストンを5%過塩素酸で抽出し、それを高速液体クロマトグラフィーC18逆相カラムでリン酸-過ヨウ素酸ナトリウム存在下アセトニトリル41%から44%の一時間の直線濃度勾配により溶出、分離した。これまで陽イオン交換樹脂Bio Rex70で一週間かけていた小成分の相互分離が一時間で終了することを考えると、この高速液体クロマトグラフィーを用いた方法の有用性は明らかである。モノクローナル抗体の作製はBalb/cマウスをHIヒストンで免疫することにより常法通り行なった。マウスミエローマ細胞としては、NS1、P3U1細胞を用い、ポリエチレングリコールで感作脾細胞と融合した。得られたHI抗体産生クローン48ケのうち1クーロン、2・1C2について詳細な検討を加えた。2.1C2の産生する抗体はΙgMであり、この抗体はすべてのHIヒストン小成分と反応性を示した。そこでその抗体認識部位を検討した。HIヒストンは中央の疎水性部(ヘッド)、N末側(ノーズ)、C末側(テール)の3部位に構造上分類される。各々の部位をトリプシン、キモトリプシン、トロンビンによるHIヒストンの限定分解により得、ウェスタンブロッティング、酵素免疫法により抗体の反応性を調べたところHIヒストンの疎水性部のC末端側のつけ根部分であることが明らかになった。すなわち、この部分がHIヒストン小成分のすべてに共通な抗原決定基であり、HIの疎水性部がDNAとHIヒストンの結合に関与していることから考え合わせると、疎水性部に隣接したC末端側の一定の構造がHIヒストンのクロマチン上での結合に重要なのであろうと考えられた。研究課題/領域番号:61571047, 研究期間(年度):1986出典：研究課題「モノクローナル抗体をもちいた,HIヒストンのクロマチン構造の調節に関する研究」課題番号61571047（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-61571047/）を加工して作

G_0期に特異的に発現されるH1ヒストン遺伝子のクローニングおよびその発現調節

金沢大学薬学部本研究では、H1ヒストン小成分、H1°ヒストンの相互分離法を確立し、それらの性状解析を行なった。さらに、細胞増殖、各組織間、伐熟過程におけるそれらの発現の違いを明らかにし、個々の小成分またはH1°ヒストンが、それらにおいて、おのおの特異的な役割を担っていることを強く示唆する結果を得た。具体的には、小成分、H1°ヒストンの相互分離は、C18カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で短時間で可能となり、これを用いて単離精製した標品から、マウス、ラットとも5種のH1ヒストン小成分と、1個のH1°を持っていることが明らかとなった。また、マウスの組織においては小成分IVが全H1ヒストン、H1°ヒストン量の40%以上をしめ、また、H1°ヒストンは胸腺、脾臓ではその存在が確認できなかった。マウスの生後の肝成熟過程において、小成分I、II、IIIは次第に減少してゆくのがみられた。小成分IVの量はほぼ変化がなく小成分Vのみ、6週令でその量が最大に達し、以後減少するのがみられた。H1ヒストン、H1°ヒストンの総量は成熟過程でほぼ一定であるが、これら小成分の減少量を補うのはH1°ヒストンの成熟過程での増加であると考えられた。実際にH1°の存在しない胸腺、脾臓では小成分V以外の小成分の量にほとんど変動がみられなかった。細胞周期においては、G_0期で特異的に発現されるのは、マウスBa1b/c3T3細胞では、III、およびH1°、ラットNRK細胞では、II、IIIであった(NRKではH1°はほとんど確認できなかった)。即ち、DNA合成と相関せずに合成されるH1°、小成分III、II(ラット)が、細胞の機能の制御機構に重要な役割を果たしていると考えられる。また、これらの特異的発現のmRNAレベルでの制御機構を知る目的で、ラットからH1ヒストン遺伝子のゲノミッククローニングを行ない、1個のクローンを得た。The expression of the H1 histone subtypes and H1^o histone in a cell cycle and during maturations of tissues were investigated. At first the method of the separtion of H1 subtypes and H1^o histone each other was developed. The five subtypes of H1 histone and H1^o histone were separated each other by use of reverse phase HPLC(C18-300), using a gradient of acetonitrile. Then, the subtypes of H1 histone and H1^o histone in tissues of mouse were investigated by use of this method. The subtype IV was more than 40% of total H1 histones in most of the tissues investigated, including liver, lung, cerebrum, heart, kidney and cerebellum. There were detected no H1^o histone in thymus and spleen. The amounts of subtypes of H1 histone during maturation of liver, changed. Subtypes I,II and III, were decreased gradually during maturation. The amount of subtype IV was almost constant during maturation. The amount of subtype V reached maximum 6 week after birth and decreased gradually. Only H1^o histone was increased during the maturation. The increase in this amount could compensate the decrease in the amounts of H1 subtypes during the maturation. The amounts of subtypes of thymus and spleen did not change during the maturation. This evidence was coincident with the evidence that there was no H1^o histone in thymus and spleen. In a cell cycle of mouse Balb/c 3T3 cells, the syntheses of H1^o histone and subtype III were detected at G0 phase. The syntheses of other subtypes occurred during S Phase. Furthermore, the H1 histone genomic DNA was cloned from rat genomic DNA library. It must be very useful to investigate the regulation of the H1 gene expression during a cell cycle traverse.研究課題/領域番号:62570981, 研究期間(年度):1987 – 1988出典：研究課題「G_0期に特異的に発現されるH1ヒストン遺伝子のクローニングおよびその発現調節」課題番号62570981（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-62570981/625709811988kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

新しいサイクリン依存性キナーゼ(cdk)による細胞周期の制御機構の解析

金沢大学薬学部哺乳類細胞の増殖制御機構におけるサイクリン依存性キナーゼの役割に関連し、このキナーゼの活性制御機構に焦点をあてた。サイクリン依存性キナーゼのうちcdc2キナーゼはその活性が燐酸化により制御されている可能性が示唆されてきている。哺乳類細胞のcdc2キナーゼの場合3カ所の燐酸化、即ちN末から14番目のトレオニン残基(14-T)、15番目のチロシン残基(15-Y)、161番目のトレオニン残基(161-T)の燐酸化、がこの活性制御に寄与していると考えられている。そこでこれらの部位を燐酸酸化、脱燐酸化する酵素を検討した。分裂酵母のweel変異を相補する遺伝子ヒトweel遺伝子産物を大腸菌で発現させその活性を検討した。その結果この大腸菌発現ヒトweel産物はチロシンキナーゼでありcdc2キナーゼの15-Yを燐酸化する酵素であることが明かとなった。酵母の分裂期進行の変異cdc25を相補する遺伝子ヒトcdc25遺伝子はこの15-Yを脱燐酸化する酵素遺伝子として期待された。実際このヒトcdc25B遺伝子産物を大腸菌で発現させその脱燐酸化酵素活性を調べるとこの酵素は燐酸化cdc2キナーゼ・サイクリンB複合体を脱燐酸化し酵素活性を回復させた。この時この酵素は燐酸化14-T、15-Y、161-Tのうち14-T、15-Yを脱燐酸化し、キナーゼ活性を回復させたが161-Tは脱燐酸化しなかった。即ちヒトcdc25B遺伝子産物はcdc2キナーゼを脱燐酸化することによって活性化するトレオニン、チロシンホスファターゼであり、しかも基質特異性が高いものであることが明かとなった。161-Tの燐酸化は上記したことからもわかるように酵素活性を不活化することはなかった。逆にこの燐酸化はこの酵素の活性に必須なことが明かとなり我々はこの哺乳類の酵素としてマウスCAK(cyclin dependent kinase activating kinase)遺伝子を単離した。The activity of cdc2 kinase is regulated by the phosphorylation and dephosphorylation of its own molecule. The phosphorylation of Thr-14 and/or Tyr-15 inhibits the kinase activity, whereas the phosphorylation of Thr-161 is necessary for the activity of this kinase. We tried to find out the kinase which phosphorylated the cdc2 kinase and inhibited the activity. Human weel kinase had such kind of activity. The kinase could phosphorylate Try-15 of the cdc2 molecule but not do Thr-14. The kinase which could phosphorylate Thr-14 now to be elucidated. The enzyme which phosphorylates this Trh-161 is named CAK(cyclin dependent kinase activating kinase). Recent work revealed Xenopus laevis p40MO15 kinase could phosphorylate this residue and activate the kinase. The DNA sequence of this kinase is homologus to that of R-2 protein which was isolated from rice cells as one of the cdks. We tried to clarify whether this R-2 protein has kinase activity to activate the cdc2 kinase. We found the R-2 kinase, which was produced in E.coli, could activate the HeLa cdc2 kinase in the presence of cyclin B.Also we isolated the mouse homologue of p40MO15. These kinases had NXTALRE sequence in stead of PSTAIRE of cdc2 kinase.研究課題/領域番号:04833008, 研究期間(年度):1992 – 1993出典：研究課題「新しいサイクリン依存性キナーゼ(cdk)による細胞周期の制御機構の解析」課題番号04833008（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-04833008/048330081993kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

Mutant p53 proteins bind DNA in a DNA structure-selective mode

Despite the loss of sequence-specific DNA binding, mutant p53 (mutp53) proteins can induce or repress transcription of mutp53-specific target genes. To date, the molecular basis for transcriptional modulation by mutp53 is not understood, but increasing evidence points to the possibility that specific interactions of mutp53 with DNA play an important role. So far, the lack of a common denominator for mutp53 DNA binding, i.e. the existence of common sequence elements, has hampered further characterization of mutp53 DNA binding. Emanating from our previous discovery that DNA structure is an important determinant of wild-type p53 (wtp53) DNA binding, we analyzed the binding of various mutp53 proteins to oligonucleotides mimicking non-B DNA structures. Using various DNA-binding assays we show that mutp53 proteins bind selectively and with high affinity to non-B DNA. In contrast to sequence-specific and DNA structure-dependent binding of wtp53, mutp53 DNA binding to non-B DNA is solely dependent on the stereo-specific configuration of the DNA, and not on DNA sequence. We propose that DNA structure-selective binding of mutp53 proteins is the basis for the well-documented interaction of mutp53 with MAR elements and for transcriptional activities mediates by mutp53

Regulation of the osteoblast-specific transcription factor Osterix by NO66, a Jumonji family histone demethylase

Osterix (Osx) is an osteoblast-specific transcription factor required for osteoblast differentiation and bone formation. Osx null mice develop a normal cartilage skeleton but fail to form bone and to express osteoblast-specific marker genes. To better understand the control of transcriptional regulation by Osx, we identified Osx-interacting proteins using proteomics approaches. Here, we report that a Jumonji C (JmjC)-domain containing protein, called NO66, directly interacts with Osx and inhibits Osx-mediated promoter activation. The knockdown of NO66 in preosteoblast cells triggered accelerated osteoblast differentiation and mineralization, and markedly stimulated the expression of Osx target genes. A JmjC-dependent histone demethylase activity was exhibited by NO66, which was specific for both H3K4me and H3K36me in vitro and in vivo, and this activity was needed for the regulation of osteoblast-specific promoters. During BMP-2-induced differentiation of preosteoblasts, decreased NO66 occupancy correlates with increased Osx occupancy at Osx-target promoters. Our results indicate that interactions between NO66 and Osx regulate Osx-target genes in osteoblasts by modulating histone methylation states