Caracterización de xiloglucano endostransglicosilasa/hidrolasa (XTH) en frutilla chilena (Fragaria chiloensis l. (mill.) y frutilla silvestre (Fragaria vesca)

157 p.La frutilla comercial (Fragaria x ananassa) es consumida por millones de personas alrededor del mundo, y es conocida por su delicado sabor y alto contenido de vitaminas. Chile es uno de los mayores productores de frutilla junto con Perú y Argentina. La mitad de la producción es consumida localmente en fresco y casi todo el resto se procesa, y solo una pequeña parte se exporta. Fragaria x ananassa es un octoploide y es un híbrido entre Fragaria virginiana Duch. y Fragaria chiloensis (L.) Mill. La frutilla chilena blanca (Fragaria chiloensis L. (Mill)) es una especie nativa de Chile, además de su sabor y aroma, es reconocida por características como gran tamaño y color característico de fruto. Ha emergido como un nuevo berry de exportación. Sin embargo, presenta problemas que necesitan ser resueltos como por ejemplo el bajo rendimiento, temporada productiva de corta duración y el rápido ritmo de ablandamiento de fruto. Fragaria vesca o frutilla silvestre ha surgido como un modelo muy atractivo para el estudio de la maduración en frutos no climatéricos debido a que presenta un genoma pequeño, es diploide, se dispone de metodología de transformación y posee un ciclo reproductivo corto. La concreción de la secuenciación del genoma de Fragaria vesca ssp. vesca accesión Hawaii 4 abre una herramienta de análisis y de referencia. El ablandamiento de fruto es producto de cambios fisiológicos y bioquímicos que ocurren en los estadios finales del desarrollo que involucran la modificación de la pared celular producto de la acción conjunta de enzimas asociadas a esta estructura. La pared celular es una estructura dinámica que se compone de polisacáridos como xiloglucanos y no polisacáridos como ligninas y proteínas. La enzima xiloglucano indotransglicosilasa/hidrolasa (XTH) es una de las enzimas asociada a pared celular y su acción afectaría la composición de la cadenas de xiloglucanos que entrecruzan las microfibrillas de celulosa. El objetivo principal de esta tesis es caracterizar la(s) XTH presentes en F. chiloensis y F. vesca y determinar la variación en la expresión de éstas durante el desarrollo del fruto. Por otro lado, es de interés el estudio de la variación en la expression de las XTH de F. chiloensis por efecto acción de hormonas vegetales. En F. chiloensis fueron identificados los genes FcXTH1 y FcXTH2. Ambos genes pertenecen a familias filogenéticas distantes y presentan una organización genómica diferente. Se analizó el perfil transcripcional de ambos genes. Los transcritos de FcXTH1 incrementaron durante el ablandamiento de los frutos, en tanto que los de FcXTH2 parecen estar relacionados con procesos vegetativos. Ensayos de actividad y de inmunodetección permitieron detectar proteína XTH y elevada actividad xiloglucano endotransglicosilasa (XET) y actividad endohidrolítica (XTH) en el estadio T (turning). El tratamiento de frutos con hormonas reveló que la expresión de los genes de XTH es modulada por algunas hormonas. Con el objetivo de explicar este comportamiento, se obtuvieron las secuencias promotoras de los genes FcXTH1 and FcXTH2. El análisis in silico reveló la existencia de putativos elementos cis que han sido descritos como elementos regulatorios de respuesta a hormonas como auxinas (ANA), ácido abscísico (ABA), giberellinas (GA3) y etileno. La fruta fue tratada con dichos reguladores de crecimiento con el fin de esclarecer su efecto en la expresión de las isoformas de FcXTH. Se observó un efecto activador de parte de ANA y GA3, y un efecto inhibitorio de etileno sobre la expresión de FcXTH1 y FcXTH2, y un efecto activador de ABA sobre la expresión de FcXTH1, lo que es consistente con la presencia de elementos regulatorios encontrados en las secuencias promotoras de los genes FcXTH1 y FcXTH2. Las XTHs pertenecen a una familia multigénica. Con el fin de identificar los genes de XTH en Fragaria vesca se utilizó la información disponible en http://www.strawberrygenome.org. La búsqueda permitió la identificación de 26 genes codificantes para FvXTHs. El nombre de cada gen fue proporcionado de acuerdo a la nomenclatura utilizada para la familia de XTH en A. thaliana. Se analizó el número de intrones y exones de cada gen y se construyó un árbol filogenético con las diferentes XTHs identificadas. Los resultados obtenidos permitieron la clasificación de los genes de XTH de F. vesca. Con el fin de identificar elementos estructurales característicos de las XTHs se realizó un análisis comparativo contrastando con XTHs resueltas experimentalmente y con la ayuda de herramientas bioinformáticas. El análisis demostró la existencia de elementos estructurales compartidos como el sitio activo, de secuencia DEIDFEFLG, la cuál es altamente conservada. También el patrón característico de hojas -plegadas y de -hélices en el extremo N-terminal está presente. Finalmente se realizó el análisis de expresión de los genes en diversos estadios de frutos y tejido vegetativo de F. vesca. El análisis de expresión relativa muestra que los genes FvXTH presentan patrones de expresión diversos de acuerdo a estadios de maduración de fruto o tejido vegetativo analizado y que éstos no se relacionan con el grupo filogenético al que pertenece. La realización de análisis funcionales permitirá ahondar en la caracterización de la función de estos genes y aclarar su participación en el proceso de maduración y ablandamiento de fruto./ABSTRACT:The commercial strawberry (Fragaria x ananassa) is consumed by millions of people around the world and it is known for its delicate flavor and high vitamin content. Chile is one of the largest producers of strawberries along with Peru and Argentina. Half of the production is consumed locally in fresh and most of the rest is processed and only a small part is exported. Fragaria x ananassa is an octoploid and is a hybrid between Fragaria virginiana Duch. and Fragaria chiloensis (L.) Mill. The white Chilean strawberry (Fragaria chiloensis L. (Mill)) is native from Chile, and in addition to its flavor and aroma, it is known for its large fruit size and characteristic color. It has been emerged as a new export berry. However, it has problems that need to be solved, such as low yield, short growing season and a fast softening rate. The wild strawberry, Fragaria vesca, has risen as a very attractive model for the study of ripening in non-climacteric fruit due to its small size genome, because it is diploid and because the availability of a transformation method and a short reproductive cycle. The sequencing of the genome of Fragaria vesca ssp. vesca accession Hawaii 4 offers an analysis and reference tool. Fruit softening corresponds to physiological and biochemical changes which occur in the last stages of fruit development and involves cell wall modifications due to the joint action of cell wall associated enzymes. The cell wall is a dynamic structure composed of polysaccharides such as xyloglucans and non-polysaccharides such as lignins and proteins. Xyloglucan endotransglycosylase/ hydrolase (XTH) is one of the enzymes associated with cell wall and its action could affect the composition of xyloglucan chains that intersect the cellulose microfibrils. The aim of this thesis is to characterize the XTHs present in F. chiloensis and F. vesca and to determine the changes in the expression of these genes during fruit development. Furthermore, it is of interest to study the changes in the expression of F. chiloensis´s XTHs promoted by plant hormones. In F. chiloensis two genes were identified, FcXTH1 and FcXTH2. Both genes belong to distant phylogenic families and have a different genomic organization. The transcriptional profile of both genes was analyzed. FcXTH1 transcripts increased during fruit softening, while those of FcXTH2 seem to be related to vegetative processes. Activity assays and immunodetection allowed the detection of XTH protein and high xyloglucan endotransglycosylase (XET) and endohydrolitic activity (XTH) at the T stage (turning). The treatment of fruit with hormones revealed that these hormones modulate the expression of XTH genes. In order to explain this behavior, the promoter sequences of FcXTH1 and FcXTH2 genes were obtained. In silico analysis revealed putative cis elements that have been described as regulatory elements responsive to hormones such as auxins (ANA), abscisic acid (ABA), giberellins (GA3) and ethylene. The fruit was treated with these growth regulators in order to elucidate the effects on the expression of FcXTH isoforms. An activator effect for ANA and GA3 treatments, and an inhibitory effect of ethylene was observed on the expression of FcXTH1 and FcXTH2 and activation on the expression of FcXTH1 by ABA, which is consistent with the presence of regulatory elements found in the promoter sequences of FcXTH1 and FcXTH2. XTHs belong to a multigenic family. In order to identify the XTH genes in Fragaria vesca the information available in http://www.strawberrygenome.org was used. The search allowed the identification of 26 genes coding for FvXTHs. The name of each gene was provided according to the nomenclature used for the XTH family in A. thaliana. The number of introns and exons of each gene was analyzed and a phylogenic tree was built with the different XTHs identified. The results allowed the classification of F. vesca XTH genes. In order to identify structural elements characteristic of XTHs a comparative analysis was performed contrasting the sequences with experimentally resolved XTHs with the help of bioinformatic tools. The analysis showed the existence of shared structural elements such as the active site, the DEIDFEFLG sequence, which is highly conserved. The characteristic pattern of -sheets and -helices at the N-terminal was also present. Finally, the expression analysis of FvXTH genes at different fruit developmental stages and in vegetative tissues was performed. The results showed that differential gene expression patterns exist according to the ripening stage or vegetative tissue and there is no relation between the patterns and the corresponding phylogenic group. Functional analyzes will allow a deeper characterization of these genes and to clarify their involvement in fruit ripening and softening

Mutagénesis sitio dirigida de un residuo conservado de la enzima alcohol acil transferasa (VpAAT1) y el rol que cumple en la biosíntesis de esteres volátiles

63 p.La papaya de montaña (Vasconcellea pubescens) posee un aroma muy característico, compuesto principalmente por ésteres. La reacción de esterificación es catalizada por la enzima alcohol aciltransferasa (VpAAT1) la cual es miembro de la familia BAHD, que transfieren un acil-CoA a un alcohol. Para obtener una perspectiva sobre el mecanismo de acción de VpAAT1, se utilizó la metodología de modelamiento comparativo para construir la estructura de la enzima. La estructura de la enzima VpAAT1 mostró dos dominios conectados por un loop, con un canal de solvente en el centro de la estructura, los dos residuos H166 y D170 que se describen como importantes para la acción catalítica, presentan sus cadenas laterales hacia la cavidad central del canal, permitiendo su interacción con los sustratos. Para evaluar si esto es realmente así, se realizó primeramente la mutación in silico del residuo de D170E, donde se observaron cambios significativos en la energía de interacción proteína-ligando y la orientación en el canal de solvente de los sustratos, de modo que la energía se torna desfavorables al interactuar los ligandos con la proteína mutante. Así mismo, estudios cinéticos sobre la enzima nativa, mostraron que existe una diferencia en los niveles de afinidad entre los distintos ligandos, tanto alcoholes como el ligando acetil-CoA, siendo este último el más favorable para la enzima, por sobre los alcoholes, esto es posible determinarlo debido a que este sustrato posee una menor KM. A modo de corroborar estos estudios in silico se evaluó de manera in vitro la mutación del residuo D170E. Los resultados de este estudio mostraron una pérdida total de la actividad, observándose una correlación con los datos bioinformáticos descritos previamente, además de confirmar el papel funcional del residuo durante la catálisis de VpAAT1, y la producción de ésteres, los cuales son componentes importantes del aroma en el fruto de papaya de montañ

Caracterizacion de clones de Cabernet Sauvignon racimo largo y corto mediante marcadores geneticos

Resumen (Spanish, English)72 p.En Chile el cultivar Cabernet Sauvignon de Vitis vinífera presenta al menos dostipos de plantas perfectamente diferenciables en el tamaño de sus racimos,denominados racimo largo y racimo corto, las cuales no presentan diferencias en elresto de sus características ampelográficas. El mutante en cuestión produce racimos demayor tamaños a los observados en el tipo común de plantas, lo cual constituye unrasgo interesante al momento de establecimiento de un viñedo. Se probaron tres técnicas de marcadores genéticos con el objetivo de generarpatrones diferenciables en el genoma de ambos tipos de Cabernet Sauvignon. Seensayaron 63 combinaciones de partidores AFLP, siete partidores de secuenciasmicrosatélites y un partidor de secuencia aleatoria. Fragmentos de amplificacióndiferenciales entre ambos clones fueron obtenidos mediante los análisis AFLP yRAPD-PCR, mientras que el uso secuencias microsatélites no permitieron detectardiferencias. De los partidores AFLP, el par E-ACC / M-CTC, amplificó un total de 25 bandasde las cuales dos se presentaron únicamente en los individuos de racimo largo, porotra parte el partidor RAPD 5'AGGTGACCGT-3', logró generar un perfil característicopara los individuos de racimo largo. Posteriores pruebas de reproducibilidad sobre unmayor numero de individuos confirmaron estos resultados, a la vez que evidenciaronperfiles de amplificación ligeramente diferentes sobre individuos de racimo corto, lo quepuede ser resultado de diferentes familias de Cabernet Sauvignon o de mutacionessomaclonales producto de la reproducción vegetativa. Por otro lado, el uso de secuencias microsatélites de la serie VVMDreportadas por Meredith y Bowers, como polimórficas en diversas familias deCabernet Sauvignon, no lograron generar patrones diferenciales de amplificación, loque puede apoyar la hipótesis de que este tipo de plantas sólo está presente en Chile

Efecto economico de las modificaciones geneticas Bt y RR en el cultivo de maiz semillero.

Resumen (Spanish, English)85 p.En la actualidad, la biotecnología ha revolucionando a gran parte de los sistemas de cultivos, dada la capacidad de incorporar genes a las plantas que otorgan características de resistencia o tolerancia a factores tanto bióticos como abióticos. Por otro lado esta tecnología implicaría un sustantivo aumento en la rentabilidad de los cultivos que han sido modificados, por el incremento de la productividad, reducción del uso de pesticidas convencionales, disminución del número de labores culturales, etc. En definitiva, una reducción significativa en los costos de producción, con el consecuente beneficio para los agricultores y para el sector agrícola nacional. El maíz es el principal cultivo genéticamente modificado que se multiplica en Chile y las modificaciones que se le imprimen son las de resistencia a insectos (Bt) y tolerancia a herbicidas (RR). En Chile, solo está permitido multiplicar semillas modificadas genéticamente para luego exportarlas, pero paradojálmente, está prohibida su comercialización para usarla como insumo productivo. Por lo anterior, se planteó este estudio cuyo objetivo general fue analizar y comparar los costos de producción del maíz semillero modificado y no modificado genéticamente y construir un escenario sobre los potenciales beneficios económicos que tendría en Chile la liberación al mercado del uso de semillas con modificaciones Bt y RR en el cultivo de maíz para grano. A través de la aplicación de encuestas a las principales empresas multiplicadoras de semillas y entrevistas con productores de maíz de grano, se obtuvo la información necesaria para lograr los objetivos de este estudio. Los principales resultados de este estudio reflejan que la producción de semillas genéticamente modificadas (Bt y RR) presentan una disminución de sus costos de producción, con respecto a la multiplicación de semillas convencional. Por otro lado, en la producción de maíz de grano se presentan una disminución de los costos de producción, por ende un aumento significativo en los márgenes brutos por hectárea en los diferentes escenarios considerados, comparado con la producción de maíz para grano que usa semilla convencional

Caracterización estructural de factores de transcripción del tipo MADS en su unión a ADN involucrado en la respuesta a inclinación de Pinus radiata D. Don

120 P.Pinus radiata D. Don es la conífera de mayor importancia en la producción forestal, sustentando cerca del 80% del abastecimiento industrial de la madera en Chile. El crecimiento normal de los árboles puede verse afectado por estrés abiótico, que provocan la pérdida de verticalidad de estos. La tensión física producida en coníferas, a causa de que el tronco busca reorientar su crecimiento vertical, genera madera de compresión, esta se caracteriza por altos niveles de lignina, menor contenido de celulosa y mayor ángulo de micro-fibra, factores que disminuyen la calidad de los productos obtenidos por la industria forestal.La madera de compresión se produce por cambios en la modulación genética de la zona afectada del tronco. Para comprender este fenómeno es necesario estudiar los genes que provocan dichas modificaciones. Se ha visto que el gen xyloglucano endotransglucosilasa/hidrolasa (XTH), que participa de la expansión y formación de la madera, es sobre-expresado en respuesta a la inclinación en el lado inferior del ápice. Por otro lado, estudios previos han mostrado la activación del factor de transcripción del tipo MADS (MCM1, AG, DEFA y SRF) implicado en procesos de desarrollo y biosíntesis de la pared secundaria a tiempos tempranos de la respuesta a inclinación. A su vez, el análisis de la región promotora del gen XTH, mostró que contiene secuencias de respuesta a factores MADS. Por este motivo, se quiso establecer si el factor de transcripción de tipo MADS podría tener alguna relación en la regulación del gen XTH.En esta tesis se estudió con dos factores de transcripción de tipo MADS: denominados PrMADBJ y PrMADBT, cuyos modelos tridimensionales fueron generados utilizando como templado la estructura PDB: 3P57, los monómeros se caracterizaron por presentar una zona coil, 2 alfa hélices y dos beta plegadas anti paralelas. Adicionalmente, se emplearon técnicas de acoplamiento molecular, con las que se pudo determinar que estos factores de transcripción MADS se unen a elementos cis-regulatorios del ADN como dímeros, a través de una zona positivamente cargada de su estructura, las técnicas de acoplamiento y dinámica molecular mostraron que la interacción proteína-ADN era favorable, y que la secuencia denominada CARG4 posee una mejor interacción con los monómeros y homo-dímeros de los PrMADS. Con esto, se pudo demostrar que los residuos positivamente cargados K23, R26, K30 y K31 situados dentro del dominio MADS de la proteína serían los responsables en la interacción ADN-proteína/ABSTRACT:Pinus radiata D. Don is the most important conifer in forest production, sustaining nearly 80% of the industrial wood supply in Chile. The growth of normal trees can be affected by abiotic stress, causing the loss of their verticality. Physical strain produced in conifers, which is caused by the trunk seeking to reorient its vertical growth, generates compression wood. This wood is characterized by high levels of lignin, less cellulose content and a greater angle of micro-fiber, factors that lower the quality of the products obtained by forest industry. Compression wood is produced by changes in the genetic modulation of the affected area in the trunk. To understand this phenomenon, it is necessary to study the genes that cause such changes. It has been found that the gene xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH), involved in the expansion and wood formation is overexpressed in response to the inclination in the lower side of the apex. Furthermore, previous studies have shown the activation of the MADS transcription factor (MCM1, AG, DEFA and SRF), which is predominantly involved in developmental processes and secondary wall biosynthesis in the early stages of the tilt response. In turn, the analysis of the promoter region XTH gene sequences shows that it contains sequences response to MADS. Therefore, this study aims to determine whether the MADS transcription factor plays a key role in XTH gene regulation.A three-dimensional model of two MADS transcription factors (MADBJ and MADBT) were generated using as template the structure PDB: 3P57. Docking were used using HADDOCK program, determining that these MADS transcription factors bind cis-regulatory elements. Docking and molecular dynamics showed that the interaction of a dimer protein and DNA was favorable. Moreover, the sequence CARG4 has a better interaction with the monomers and homo-dimers of PrMADS. It was demonstrated that the positively charged residues K23, R26, K30 and K31 located within the MADS domain of the protein allowed the binding specificity

Identificación y caracterización de promotores de genes de ablandamiento de fruto en el genoma de referencia Fragaria vesca: su correspondencia en el genoma de Fragaria chiloensis

83 p.La frutilla comercial (Fragaria x ananassa) pertenece a la familia Rosácea género Fragaria. Es considerada el berry más consumido y posee cualidades organolépticas llamativas como color, aroma y sabor intenso, siendo más atractivo para el consumidor. Por su parte, Fragaria vesca ssp. vesca es una especie de tamaño pequeño, color blanco y aquenios café, poco cultivada por la aparición de variedades más atractivas al mercado, sin embargo, es considerada como modelo de estudio, por tener un genoma pequeño (214,37 Mb), diploide y ser la única frutilla cuyo genoma ha sido secuenciado en su totalidad. Fragaria chiloensis ssp. chiloensis es una frutilla blanca de aquenios rojos, comercializada fundamentalmente en áreas locales, pero que también se está introduciendo en otros mercados como fruto exótico, sin embargo, presenta un rápido ablandamiento, aún antes de su cosecha, lo que resulta un impedimento para su comercialización. Por esto, el proceso de maduración, y el ablandamiento en particular, resultan relevantes en estudios de mejoramiento de esta especie, ya que su textura, aroma y sabor son características deseadas por los consumidores. El proceso de ablandamiento ha sido relacionado a disminución del turgor, por pérdida de agua, y particularmente, desensamblaje de la pared celular. Con respecto al desensamblaje de la pared celular, se han estudiado enzimas que están involucradas en este proceso, y por consiguiente con el ablandamiento de frutilla, algunas de estas enzimas son: poligalacturonasas, expansinas, pectato liasas, endobeta- 1,4-glucanasa, pectina metilesterasas, XTH, beta-galactosidasa, entre otras. En esta investigación se analizaron las regiones promotoras de los genes que codifican para éstas enzimas relacionadas a ablandamiento en frutilla, identificando elementos de respuesta a las fitohormonas, ácido abscísico, auxina y etileno y para los factores de transcripción (FT) de tipo MYB, MYC y bHLH en el genoma de F. Vesca. Además, se analizó la librería por hibridación sustractiva supresiva de F. Chiloensis, construida a partir del proceso de maduración de fruto. De esta manera se generó nueva información sobre posibles formas de regulación en estas enzimas asociadas al ablandamiento en fruto./ABSTRACT: The commercial strawberry belongs to the Rosacea family and Fragaria genus. This berry is considered the most consumed in both, fresh and processed product (such as juices or jams). Besides, this fruit has high organoleptics qualities that are striking like intense color, aroma and flavor, which make it more attractive to consumers. Fragaria vesca ssp. vesca is a small sized fruit, white receptacle and brown achenes, rarely cultivated by the appearance of more attractive varieties to the market, however, is considered as a study model for having a small genome (214,37 Mb), diploid and be the only strawberry whose genome has been fully sequenced. Moreover, Fragaria chiloensis ssp. chiloensis is a native strawberry with white receptacle and red achenes, commercialized by small farmers, mainly due to the fast fruit softening at harvesting. Therefore, the process of maturation and softening are relevant for breeding purposes, because its texture, aroma and flavor are desired characteristics for consumers. The softening process has been related to the decrease of turgor, because of the loss water, and disassembling of the cell wall, among others reasons. Has been studied that these disassembling is related to enzimes that catalize cellular components like pectins and hemicellulose, these enzimes are polygalacturonase, endo-beta-1,4- glucanase, pectate lyase, pectin methylesterase, XTH, beta-galactosidase, expansin, among others. In this study the promoter of genes that code the enzimes related to softening in strawberry were analyzed, and identified response elements to the fitohormones, abscisic acid, auxin and ethylene and also to the transcription factors MYB, MYC and bHLH in the F.vesca genome and using the suppressive subtractive hybridization library from F. chiloensis. Thus, has been generated new information about the regulation of these genes involved in the cell wall disassembling and softening in strawberr

Caracterización de variantes alelicas y estructurales de hemoglobinas no simbióticas en portainjertos de frutales de carozo (Prunus sp. L.) con diferentes niveles de tolerancia a la asfixia radical.”

112 p.La hipoxia o asfixia radical restringe el desarrollo de huertos frutales de carozo en Chile, originándose por inundación o irrigación inadecuada en suelos con mal drenaje. En general, los frutales de carozo se injertan en portainjertos (del género Prunus L.) que determinan su tolerancia a la asfixia radical. La variabilidad de la respuesta de las especies del género Prunus a la hipoxia radical sugiere que diferentes estrategias habrían evolucionado en el género para enfrentar este estrés. Sin embargo, las bases moleculares de esta variación son casi desconocidas. Análisis moleculares de las respuestas de angiospermas a la asfixia radical sugieren que las Hemoglobinas no simbióticas (nsHb) cumplen un rol importante. Análisis preliminares muestran la existencia de variaciones nucleotídicas y aminoacídicas en los genes y en proteínas nsHb de Prunus, sugiriendo la existencia de polimorfismos interespecíficos que podrían producir la variación fenotípica. Esta memoria planteó: 1) Analizar las variaciones alélicas de nsHb en especies del género estudiando secuencias nucleotídicas de genes nsHb aislados, clonados y secuenciados desde genotipos representativos de 3 subgéneros de Prunus; 2) Estudiar la relación de los alelos de nsHb encontrados con la tolerancia/sensibilidad al estrés por hipoxia de los genotipos estudiados y 3) Analizar, por modelos tridimensionales y estudios de unión de ligandos, el potencial impacto de variaciones alélicas en estructura y funcionalidad de las nsHb. En esta memoria se estudiaron las nsHb de distintos portainjertos del género Prunus con especial énfasis en la estructura y su unión con ligandos gaseosos. Se trabajó con secuencias pertenecientes a los tres subgéneros de Prunus para indagar en su historia evolutiva y con las estructuras de nsHbs de Mariana y Mazzard F12, cuyos modelos tridimensionales fueron generados utilizando como templado la estructura PDB 3QQQ Palabras claves: estructura tridimensional, hemoglobinas, hipoxia, ligandos, Mariana, Mazzard F12, nsHb, óxido nítrico, oxígeno, Prunus.. /ABASTRACT:The radical hypoxia or asphyxia restricts the development of stone fruit orchards in Chile, originated by flooding or inadequate irrigation in soils with poor drainage. In general, stone fruit trees are grafted onto rootstocks (genus Prunus L.) which determine their tolerance to radical asphyxia. The variability on the response of species from the Prunus genus to the radical hypoxia, suggests that different strategies have evolved in the genus to address this stress. However, the molecular base of this variation is almost unknown. Molecular analyzes of the responses in angiosperms to radical asphyxia, suggest an important role of non-symbiotic hemoglobins (nsHb). Preliminary analyzes show the existence of nucleotide and amino acid changes in nsHb genes and proteins of Prunus, suggesting the existence of interspecific polymorphisms that could produce phenotypic variation. This thesis follows: 1) To analyze the allelic diversity of nsHb in species of the genus, studying nucleotide sequences of nsHb from 3 representative subgenera of Prunus genotypes , 2) To study the relationship of nsHb alleles found with tolerance / hypoxic stress sensitivity of the genotypes studied and 3) to analyze, by three-dimensional models and ligand binding studies, the potential impact of allelic variations in structure and functionality of nsHb.The nsHbs of different rootstocks of genus Prunus was studied in this thesis with special emphasis on structure and ligands interactions. We worked with sequences belonging to three Prunus subgenus to investigate its evolutionary history and structures in nsHbs from Mariana and Mazzard F12 cultivars, whose threedimensional models were generated using as template the PDB structure 3QQQ Keywords: three-dimensional structure, hemoglobins, hypoxia, ligands, mariana, mazzard F12, nsHb, nitric oxide, oxygen, Prunus

Caracterización estructural de FCXTH 1 y FCXTH 2 asociados al desarrollo y maduración del fruto de Fragaria chiloensis (L). Duch.

78 p.La frutilla chilena (Fragaria chiloensis) surge como una nueva alternativa comercial, debido a sus excelentes características organolépticas. Su fruto es de rápido ablandamiento, reflejado en la alteración de la textura del fruto, que influye negativamente en la sobrevida de postcosecha y calidad, limitando su comercialización. Estudios previos han demostrado que el ablandamiento esta relacionado con la alteración de la pared celular, lo que corresponde a una serie de modificaciones de los polisacáridos que la componen. Los xiloglucanos (XG), polisacáridos abundantes en la pared celular, entrecruzan las microfibras de celulosa otorgándole rigidez a la pared. Se piensa que la modificación de las cadenas de XG estaría involucrada en la alteración observada en la pared, lo que resulta en el ablandamiento del fruto. La enzima xiloglucano endotransglicosilasa / hidrolasa (XTH) presente en todos los tejidos vegetales, presenta alta afinidad a xiloglucano y posee actividad endotransglicosilasa (XET), endohidrolasa (XEH), o ambas. En F. chiloensis se han identificado dos genes, que presentan alta similitud de secuencia con miembros de la familia de las XTH. Fc-XTH1, presenta alta acumulación de transcritos especialmente en fruto y Fc-XTH2 relacionado con los procesos vegetativos como el crecimiento de las hojas. Con el fin de aportar nuevos antecedentes en el proceso de ablandamiento del fruto, y obtener una perspectiva sobre el mecanismo de acción a nivel molecular de las enzimas FcXTH1 y FcXTH2, se realizó modelamiento comparativo para construir las estructuras de éstas enzimas. Además, se exploró la interacción de sustratos xiloglucano (XG) con la proteína, usando simulaciones de acoplamiento molecular. Ambas enzimas mostraron energías favorables de afinidad para sustratos XG, sin embargo, la estabilidad del complejo depende del estado de glicosilación de FcXTH. Simulaciones de dinámica molecular evidenciaron una marcada estabilidad de ambas proteínas al estar glicosiladas con 9 manosas (9m). La estabilidad de los complejos fue evaluada a través de cálculos de energía libre de unión con el método MM-GBSA. Los datos son congruentes con un probable papel de XTH durante el desarrollo y maduración del fruto./ABSTRACT: The chilean strawberry (Fragaria chiloensis) appears as a new commercial alternative, due to its excellent organoleptics. Fragaria chiloensis’s fruit with fast softening, which is reflected in the alteration of the texture of the fruit that affects negatively the survival and quality of the postharvest, restricting its merchandising. Previous studies have demonstrated that the softening is related to the alteration of the cell wall, which corresponds to modifications of the constituent polysaccharides. The xyloglucans(XG), abundant polysaccharides in the cell wall, crisscross microfibers of cellulose providing stiffness to the wall. This phenomenon could be due to that the modification of XG chains would be involved in the alteration observed in the wall, which results in softening of the fruit. The xyloglucan endotransglycosylase enzyme / hydrolase (XTH) present in all vegetables tissues, exhibits high affinity to xyloglucan and possesses endotransglycosylase actvity (XET),endohydrolase activity (XEH) , or both. In F. chiloensis have been identified two genes that show high similitude of sequence with members of the XTH family. Fc-XTH1, presents high accumulation of transcripts, especially in fruit and Fc-XTH2 is related to the vegetative processes such as leaf growth. With the purpose of providing new information in the process of fruit softening and obtaining a perspective about the mechanism of action to molecular level of enzymes FcXTH1 and FcXTH2, comparative modeling was performed to build the structures of these enzymes. Moreover, the interaction of xyloglucan (XG) substrates with the protein was explored, by using molecular Docking simulations. Both enzymes showed favorable energies of affinity for XG substrates. However, the stability of the complex depends on the state of FcXTH glycosylation. Molecular dynamics simulations showed a marked stability of both proteins by being glycosylated with 9 mannose (9m). The stability of the complexes was evaluated through calculations of binding free energy with the MM-GBSA method. The data are consistent with a probable role of XTH during development and the fruit ripening

Caracterización de patrones genéticos en 6 cultivares de Vitis vinifera L. mediante la técnica RAPD-PCR

Resumen (Spanish, English)60 p.En los viñedos Chilenos, desde hace décadas se han identificado erróneamente cultivares de Vitis vinifera L., especialmente de origen francés. Es así como se han confundido entre si los cultivares Merlot, Carmènére y Cabernet Franc, este último incluso con cv. Cabernet Sauvignon. Por otro lado, entre las variedades blancas, es clásica la confusión entre los cultivares Sauvignon Blanc y Sauvignonasse. Esta confusión se mantiene en la actualidad, entre otros factores por la carencia de viveros especializados que realicen un programa de selección y certificación de vides. Por otra parte, se han utilizado métodos poco objetivos en la identificación de estos cultivares, como es el caso del análisis ampelográfico. Además, ésta técnica se ha visto limitada en el país por la carencia de ampelógrafos experimentados. Producto de lo anterior, el presente estudio propuso caracterizar estos cultivares mediante una técnica más objetiva y precisa, como lo es la obtención de patrones genéticos generados por la amplificación del ADN mediante la técnica RAPD-PCR. Se ensayaron 10 partidores de secuencia arbitraria, de los cuales 2 permitieron diferenciar los 6 cultivares en estudio. La secuencia nucleotídica 5´-AGGTGACCGT-3` diferenció molecularmente los 4 cultivares tintos mediante la amplificación de 4 fragmentos de ADN polimórficos. Sin embargo, este partidor fué poco útil para diferenciar los cultivares Sauvignon Blanc y Sauvignonasse. La diferenciación de ambas se logró mediante el partidor de secuencia 5´-GAAACGGTG-3´, el cual amplificó dos bandas discriminatorias. Mediante el uso de esta técnica es posible obtener en forma reproducible los patrones genéticos para estos 6 cultivares. Por lo tanto, RAPD-PCR puede ser usada como una herramienta complementaria al análisis ampelográfico, de manera de facilitar la identificación de estos cultivares

Caracterización estructural de la enzima PhpAAT1 implicada en la producción de ésteres en Physalis peruviana

65 P.El fruto de Goldenberry (Physalis peruviana L.) presenta características de una baya de tipo climatérica con un agradable e intenso aroma, debido principalmente a la presencia de ésteres. La enzima alcohol aciltransferasa (PhpAAT) presente en el fruto de Physalis, es la encargada de sintetizar ésteres mediante reacciones de esterificación entre alcoholes y acil-CoAs. Esta enzima pertenece a la superfamilia BAHD, cuyos miembros presentan bajos niveles de identidad de secuencia (entre 25 – 34%), a pesar de que sus estructuras secundarias se muestran altamente conservadas. Recientemente, se ha logrado aislar un cDNA de largo completo (PhpAAT1) desde P. peruviana, que codifica para una secuencia polipeptídica de 429 aminoácidos y muestra los motivos característicos de la superfamilia BAHD. Esta presenta dos dominios: HXXXD, que tiene implicancia en la reacción de esterificación, y DFGWG, que cumple una función estructural. Con el objetivo de entender cuál es el mecanismo de acción de esta enzima, y además, caracterizar la interacción de sustratos de alcoholes y acil-CoAs que modulan la generación de los diferentes ésteres, se realizó un modelamiento comparativo para construir la estructura de la enzima. Así también, mediante simulaciones de acoplamiento proteína-ligando (Docking) y dinámica molecular, se evaluaron los posibles modos de unión de los sustratos alcoholes y acil-CoAs frente a la enzima. Los resultados de docking arrojaron que los sustratos de alcohol se orientaron hacia el residuo ASP158 y los sustratos de acil-CoAs hacia el residuo HIS154, el análisis de los complejos de la enzima con ambos sustratos mostraron que butanol y hexanoil-CoA presentan mayor estabilidad en el canal de solvente de la enzima, lo cual fue corroborado por dinámicas moleculares. Adicionalmente, cálculos de APBS realizados mostraron las diferencias de cargas en la estructura de la enzima, lo cual permite dilucidar el hecho de que cada sustrato entre por un sitio determinado al canal de solvente para interactuar con el dominio HXXXD. Estos resultados permiten obtener una aproximación que nos conduzca al esclarecimiento de cómo es la afinidad de la enzima PhpAAT1 por los sustratos para la formación de ésteres en el fruto de P. peruviana./ABSTRACT: Goldenberry (Physalis peruviana L.) is a climateric fruit with a strong aroma. The aroma in goldenberry is principle cause by the presence of esters. Alcohol acyltransferase (PhpAAT) is the main enzyme in the biosynthesis of the esters by the esterification of alcohol and acyl-CoAs. PhpAAT belong to the large family of BAHD, where the main feature is the low sequence identity (25-34%) although their structure are highly preserved. In present, the full cDNA sequence (PhpAAT1) is available, the sequence encode a 429 aminoacids sequence and present 2 main motifs of BAHD family (HXXXD and DFGWG). The HXXXD motif have a important role in the esterification reaction, whereas the DFGWG motif have a structural funtion. The main objetive of this work is the determination of mechanism of the enzyme and characterize the interaction between alcohol susbtrate and acyl-CoAs for the biosynthesis of different esters. To result this objetive i did a comparative modeling to make the structure of the enzyme. In addition, through protein-ligand linkage’s simulations (docking) and molecular dynamic, evaluated the possible modes of binding of substrates of alcohol and acyl-CoAs against the enzyme. The docking’s results showed that the substrates of alcohol were directed to residue ASP158 and the substrates of acyl-CoAs directed to residue HIS154, the analysis of both substrate show butanol and hexanoil-CoA are the most estable in the solvent channel with negative energy interaction, this reasult was corroborated by molecular dynamic. In addition, APBS result show the differents in charges in the enzyme structure, this result can elucidate the fact of each substrate enter in a specific solvent channel and later interact with HXXXD motif. The result of this work present an approximation of the substrate affinity of PhpAAT1 in the biosynthesis of esters in P. peruviana