A triadin szerepe a szarkoplazmatikus retikulumból történő kalcium-felszabadulás folyamatában harántcsíkolt izmon = The role of surface membrane and sarcoplasmic reticular proteins in acquired and hereditary muscle disorders

A szarkoplazmatikus retikulum (SR) kalcium csatornája (RyR) több fehérjével is kölcsönhatásban áll. Ide tartozik a 95 kDa-os molekulasúlyú triadint (Trisk 95), melynek alternatív splicingjával többféle molekulasúlyú izoformája jöhet létre. A Trisk 95 funkciójának felderítésére létrehozott triadin knockout (KO) egerek izmai gyengébbek és a kalciumhomeosztázisban résztvevő fehérjék expressziós szintje változott. Eredményeink szerint a triadin hiánya izom myopathiához vezethet és az általunk létrehozott állatmodellel ez jól tanulmányozható. A Trisk 95 további szerepét C2C12 izomsejteken és primer vázizomtenyészeteken tanulmányoztuk. A fehérje stabil overexpressziója csökkentette az elemi kalcium felszabadulási események (ECRE) amplitúdóját és frekvenciáját, és a depolarizáció által kiváltott Ca2+-tranzienseket. Ugyanakkor az endogén triadinexpresszió shRNS-sel történő gátlása után az ECRE-k jelentősen gyakoribbak voltak. Így feltételezhető, hogy a Trisk 95 fehérje negatívan szabályozza a RyR működését. A 32 kDa-os molekulasúlyú triadint (Trisk 32) L6.G8 myoblastokban termeltettük túl. A transzfekció nem befolyásolta a sejtek életképességét, ugyanakkor a sejtek proliferációs képessége lecsökkent. Kimutattuk a Trisk 32 és az IP3R kolokalizációját és közvetlen fizikai kapcsolatát. Funkcionális kapcsolatukat is bizonyítottuk, mivel a Trisk 32 overexpressziója szignifikánsan nagyobb amplitúdójú és felszálló meredekségű Ca2+-tranzienseket eredményezett az IP3 útvonalon keresztül. | The calcium release channel (ryanodine receptor, RyR) of the sarcoplasmic reticulum (SR) is associated with different proteins. One of them is the 95 kDa molecular weight triadin (Trisk 95) which has various isoforms with different molecular weights, all of them are splice variants of the same gene. To explore the function of Trisk 95 we generated a triadin knockout (KO) mouse which is characterized by a weaker skeletal muscle force than the control animals. Also, in case of the KO animals, the expression levels of the proteins which play role in calcium homeostasis, was changed. These results indicate that the lack of triadin can cause muscle myopathy and our animal model is suitable to investigate it. To further study the role of Trisk 95, the protein was investigated in C2C12 skeletal muscle cells and in primary skeletal muscle cultures. The constant overexpression of the protein decreased the amplitude and frequency of the elementary calcium release events (ECRE). Furthermore, the silencing of endogenous triadin expression with shRNA led to more frequent ECREs. These results suggest that Trisk 95 is a negative regulator of RyR function. Finally the 32 kDa molecular weight triadin (Trisk 32) was overexpressed in L6.G8 myoblasts. We showed the colocalization and direct physical interaction of Trisk 32 and IP3 receptor. Their functional interaction was also proved as the overexpression of Trisk 32 caused greater Ca2+-transients

Regulation of Intracellular Calcium Homeostasis in Skeletal Muscle Cells

Kísérleteink célja a tenyésztett vázizomsejtek kalciumhomeosztázisának, valamint a kalciumfelszabadulás hátterében álló elemi eseményeknek a vizsgálata volt. Az eredményeink azt mutatják, hogy az ATP megemeli az [Ca2+]ic szintjét mind humán, mind egér tenyésztett vázizomsejteken. A tranziensek vagy lassú, monoton emelkedést mutattak, vagy kétfázisúak voltak, ahol az első, gyorsan kialakuló komponenst egy lassabb, második kalciumbeáramlás követte. A kalciumtranziensek amplitúdója a sejtek differenciálódásának előrehaladtával kezdetben nőtt. Az emelkedés az 5-10 magvú izomcsövek stádiumában érte el a maximumát, majd az amplitúdók csökkenni kezdtek. Ezzel szemben a K-depolarizációval, acetilkolinnal, valamint koffeinnel kiváltható válaszok nagysága a sejtek differenciálódásával párhuzamosan nőtt. Ez egyrészt a feszültségfüggő folyamatok kiépülésével, és a nyugalmi membránpotenciál hiperpolarizáltabb irányba történő megváltozásával illetve az intracelluláris raktárak fejlődésével magyarázható, másrészről a receptorok számának differenciálódás alatti csökkenése is megfigyelhető. Az ATP adagolásával deszenzitizációt nem mutató, befelé irányuló áramot lehetett kiváltani. Az áramgörbék felszálló szára igen meredek, az áram maximumát körülbelül 300 ms alatt éri el. Az ATP hatásait nem befolyásolta a nAchR antagonista d-tubokurarin, ami azt igazolta, hogy az ATP nem a nikotin-típusú acetilkolin receptoron keresztül hat, hanem egy ionotróp purinoreceptor aktiválódását idézi elő. A depolarizáció, a feszültségfüggő csatornák gátlása, valamint a külső kalcium eltávolítása főként az ATP alkalmazásával kiváltható fluxusok gyors komponensét csökkentette. A purinoreceptorokat gátló suramin koncentrációfüggő módon csökkentette az ATP alkalmazásával kiváltható válaszokat. Ezzel összhangban mind P2X, mind P2Y purinoreceptorok jelenlétét sikerült immuncitokémiai módszerekkel is kimutatni. Az ATP hosszantartó alkalmazása a tenyésztett vázizomsejtek proliferációját csökkentette, míg a differenciálódást elősegítette. Az ATP ezen hatása valószínűleg a PKC rendszeren keresztül, a foszfatidil-inozitol jelátviteli útvonalon keresztül valósul meg. Kísérleteinkben sikerült meghatározni az egész sejtre kiterjedő kalciumfelszabadulások hátterében álló, elemi kalciumfelszabadulási események jellemző paramétereit emlős vázizomban. Kimutattuk, hogy a timol megváltoztatja ezeket a paramétereket, növeli az események előfordulási valószínűségét, csökkenti az amplitúdót és a térbeli kiterjedést, de az események időtartamát megnyújtja. Kis koncentrációban alkalmazva a szert az események megoszlása is megváltozik, az „ember”-ök és az összetett események gyakrabban fordulnak elő, mint kontroll körülmények között. Nagy koncentrációban alkalmazva a timol több száz szekundum hosszú elemi kalciumfelszabadulásokat idéz elő. Ezek az eredmények hozzájárulhatnak a vázizomsejtek kalciumhomeosztázisának jobb megismeréséhez.Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés ; Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Általános Orvostudományi Kar, Élettani Intézet, 2004Ph

<span style="font-size:15.0pt;mso-bidi-font-size:16.0pt;font-weight:normal" lang="EN-US">Analysis of osmotic stress induced Ca²⁺ spark termination <span style="font-size:15.0pt;mso-bidi-font-size:16.0pt;mso-ansi-language: EN-GB;font-weight:normal" lang="EN-GB">in mammalian skeletal muscle<span style="font-size:15.0pt; mso-bidi-font-size:16.0pt;font-weight:normal" lang="EN-US"> </span></span></span>

411-418Ca2+ sparks represent synchronous opening of the ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels located at the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Whereas a quantal nature of Ca2+ sparks has been defined in cardiac muscle, the regulation of Ca2+ sparks in skeletal muscle has not been well-studied. Osmotic-stress applied to an intact skeletal muscle fiber can produce brief Ca2+ sparks and prolonged Ca2+ burst events. Here, we show that termination of Ca2+ bursts occurs in a step wise and quantal manner. Ca2+ burst events display kinetic features that are consistent with the involvement of both stochastic attrition and coordinated closure of RyR channels in the termination of SR Ca2+ release. Elemental unitary transition steps could be defined with a mean DF/F0 of ~0.28, corresponding to the gating of 1-2 RyR channels. Moreover, the amplitude of the elemental transition steps declines at the later stage of the burst event. In tandem Ca2+ burst events where two Ca2+ bursts occur at the same position within a fiber in rapid succession, the trailing event is consistently of lower amplitude than the initial event. These two complementary results suggest that SR Ca2+ release may be associated with local depletion of SR Ca2+ stores in mammalian skeletal muscle. </span