Brasilialainen Nostoc sp. CENA543 –syanobakteeri ja sen tuottamat bioaktiiviset aineet

Syanobakteereita eli sinileviä kasvaa runsaasti kaikkialla maapallolla erilaisissa ympäristöis-sä maalla, vedessä ja symbiooseissa muiden organismien kanssa. Syanobakteerit ovat maailman historian ensimmäisiä oksygeenisiä fotosynteettisiä organismeja ja monet pystyvät myös sitomaan ilmakehän typpeä, jonka vuoksi ne ovat tärkeitä alkutuottajia monissa ekosysteemeissä. Parhaiten syanobakteerit tunnetaan arkipuheessa kuitenkin niiden myrkyl-lisyyden takia. Syanobakteerit tuottavat lukemattomia bioaktiivisia aineita, joista monet ovat muille organismeille myrkyllisiä. Näiden aineiden joukosta on löydetty myös mahdollisuus uusien lääkeaineiden kehittämiseen. Suuri osa näistä bioaktiivisista aineista tuotetaan ei-ribosomaalisen peptidisynteesin ja polyketidisynteesin kautta. Nostoc sp. CENA543 on Brasilian Pantanal-kosteikolta eristetty syanobakteeri, jonka huomattiin tuottavan maksamyrkyllistä nodulariinia, bioaktiivisia anabaenopeptiinejä ja aikai-semmin tuntematonta peptidiä. Tässä työssä selvitettiin tuon aikaisemmin tuntemattoman peptidin kemiallinen rakenne, tuotantomäärä, sen tuotantoon käytettyjen geenirykelmien toiminta ja trypsiini entsyymiaktiivisuuden inhibitiovoimakkuus. Lisäksi tutkittiin nodulariinin määrä sekä nodulariinin ja anabaenopeptiinin tuotantoon käytettujä biosynteesigeenejä. Eräänä tutkimuskohteena oli myös optimaalisten kasvatusolosuhteiden tutkiminen. Uuden yhdisteen kemiallisen rakenteen selvittämisessä käytettyjä keskeisimpiä mene-telmiä olivat nestekromatografia ja massaspektrometria. Uuden yhdisteen, nodulariinin ja anabaenopeptiinien biosynteesigeenien tutkimisessa käytettiin DNA:n eristystekniikoita ja bioinformatiikan menetelmiä, esimerkiksi AntiSMASH, BLAST, Artemis ja BioEdit -ohjelmia. Kasvatusolosuhteita tutkittiin erilaisilla kasvatusalustoilla. Yhdisteiden bioaktiivisuutta tutkittiin kiekkodiffuusiotesteillä ja trypsiini-inhibitiota Kawabatan entsyymiaktiivisuusmetodilla. Työn tuloksena todettiin Nostoc sp. CENA543-kannan tuottavan nodulariinia selvästi myrkyllisinä määrinä. Uuden, spumigiineja läheisesti muistuttavan peptidiryhmän nimeksi annettiin pseudospumigiinit. Pseudospumigiineja löydettiin kuusi eri varianttia, joista selvästi suurin tuotto oli Pseusospumigiini A:lla, jonka rakenne on Hpla-D-Hty-L-Ile-Argininaali ja massa 612,4 Da. Nodulariinin ja anabaenopeptiinien biosynteesigeenit vastasivat rakenteil-taan Nodularia spumigena CCY9414 vastaavia geenejä. Pseudospumigiinin biosynteesigee-nit muistuttivat huomattavasti Nodularia spumigena CCY9414 – kannan spumigiinin biosyn-teesigeenejä. Adenylaatiodeomeenin substraattispesifisyyden muutos ja kolmen ja kolmen muun geenin deleetio selittäisi pseudospumigiinin ja spumigiinin eron.Cyanobacteria, also referred as blue-green algae, are abundant everywhere on earth inhabi-ting terrestrial and marine environments and living in symbiosis with several other organisms. Cyanobacteria were the first oxygenic photosynthetic organisms on earth and many species are also capable of fixing atmospheric nitrogen which makes them important primary produ-cers in many ecosystems. Cyanobacteria are nevertheless best known for producing toxic compounds. Cyanobacteria produce a variety of bioactive compounds including toxic ones. Some of these compounds have a potential as drugs. Most of these compounds are produ-ced by nonribosomal peptide synthetases and polyketide synthases. Nostoc sp. CENA543 is a cyanobacteria isolated from Brazilian wetland Pantanal. The strain was found to produce hepatptoxic nodularin, bioactive anabaenopeptins and a pre-viously unkown peptide. In this work the chemical structure and the biosynthetic gene cluster of the unkown peptide were characterized. Amount of produced nodularin was measured and biosynthetic genes of nodularin and anabaenopeptins were examined. Also the optimal growth conditions for the strain were studied. Essential methods applied in this work were liquid cromatography and mass spectromet-ry. To examine the biosynthetic genes DNA extraction methods and bioinformatic tools such as AntiSMASH, BLAST, Artemis and BioEdit were applied. The growth conditions were in-vestigated on different growth media. Bioactivity of the compounds were examined on disc diffusion assays and with the Kawabata method for enzyme activity. The results of this study show that Nostoc sp. CENA543 produces toxic amounts of no-dularin. The novel peptide group was named pseudospumigins. Six variants of pseudospu-migins were observed, the main variant being pseudospumigin A. Amino acid sequence of pseudospumigin A is Hpla-D-Hty-L-Ile-Argininal with mass of 612,4 Da. Gene clusters of nodularin and anabaenopeptin match corresponding genes of Nodularia spuimigena CCY9414. The biosynthetic genes of pseudospumigin have high resemblance to spumigin genecluster of Nodularia spuimigena CCY9414. Change in adenylation domain substrate specificity and deletion of three additional genes would axplain the difference between pseu-dospumigins and spumigins

The structure and biosynthesis of heinamides A1-A3 and B1-B5, antifungal members of the laxaphycin lipopeptide family

Laxaphycins are a family of cyclic lipopeptides with synergistic antifungal and antiproliferative activities. They are produced by multiple cyanobacterial genera and comprise two sets of structurally unrelated 11- and 12-residue macrocyclic lipopeptides. Here, we report the discovery of new antifungal laxaphycins from Nostoc sp. UHCC 0702, which we name heinamides, through antimicrobial bioactivity screening. We characterized the chemical structures of eight heinamide structural variants A1-A3 and B1-B5. These variants contain the rare non-proteinogenic amino acids 3-hydroxy-4-methylproline, 4-hydroxyproline, 3-hydroxy-d-leucine, dehydrobutyrine, 5-hydroxyl beta-amino octanoic acid, and O-carbamoyl-homoserine. We obtained an 8.6-Mb complete genome sequence from Nostoc sp. UHCC 0702 and identified the 93 kb heinamide biosynthetic gene cluster. The structurally distinct heinamides A1-A3 and B1-B5 variants are synthesized using an unusual branching biosynthetic pathway. The heinamide biosynthetic pathway also encodes several enzymes that supply non-proteinogenic amino acids to the heinamide synthetase. Through heterologous expression, we showed that (2S,4R)-4-hydroxy-l-proline is supplied through the action of a novel enzyme LxaN, which hydroxylates l-proline. 11- and 12-residue heinamides have the characteristic synergistic activity of laxaphycins against Aspergillus flavus FBCC 2467. Structural and genetic information of heinamides may prove useful in future discovery of natural products and drug development.Peer reviewe

Cyanobacterial specialized metabolites : biosynthesis, bioactivity and structure

Cyanobacteria produce a variety of toxins and a diversity of other specialized metabolites. Specialized metabolites are compounds produced by an organism to interact with the environment and provide protection against competitors, predators, or abiotic factors. The biosynthetic pathways for generating specialized metabolites are typically encoded in compact gene clusters that encode multiple biosynthetic enzymes. The structure and biosynthesis of all major cyanobacterial toxins have been resolved, but new compounds with variable functions are continuously discovered and their biosynthetic origins elucidated. Cyanobacterial specialized metabolites are widely held to have great potential in the pharmaceutical industry given the increasing need for new drugs that target infectious disease and cancer. A better understanding of the chemical structure of the compounds facilitates discovery of their biological targets and their ecological role. The aim of this study was to discover new potential drug leads from cyanobacteria, focusing on antifungal compounds, and describe their structure, activity, and biosynthetic origins. Laxaphycins are unusual specialized metabolites that consist of two distinct macrocyclic lipopeptides with either 11 or 12 amino acids. They are known to have synergistic antiproliferative and antifungal activities but unknown biosynthetic origins. Here, new chemical variants of laxaphycin family specialized metabolites were discovered from Nostoc sp. UHCC 0702 and Scytonema hofmannii PCC 7110. The laxaphycin biosynthetic gene cluster was discovered, organized as a branching pathway, with initiating enzymes participating in the biosynthesis of both different lipopeptide groups. The biosynthetic gene cluster was described in both Scytonema hofmannii PCC 7110 and Nostoc sp. UHCC 0702. New laxaphycin variants heinamides were discovered with unforeseen structural moieties and I present predictions for their origins. I confirmed that heinamides also displayed synergistic antifungal activity. The connection of the 11- and 12- amino acid residue compounds is also evident at the genetic level with the common biosynthetic enzymes of the synergistic compounds. Aeruginosins are common cyanobacterial tetrapeptides with inhibitory activity against serine proteases. Trypsin isoforms have recently been studied as a target in cancer treatment. Here pseudospumigins, new aeruginosin variants, were discovered from Nostoc sp. CENA 543. Pseudospumigins are produced through a PKS/NRPS pathway similar to known aeruginosin biosynthetic gene clusters. Pseudospumigin A acts as weak trypsin inhibitor, with time dependent IC50 value of 4.5 ȝM. Nodularin-R, a cyanotoxin, was also found from the same strain. The nodularin concentration was much higher than what has been seen in a Nostoc strain before, comparable to nodularin concentrations in the most common nodularin producers Nodularia spumigena. This study describes new cyanobacterial specialized metabolites and biosynthetic enzymes for their biosynthesis, broadening the knowledge in areas of novel structural elements, biosynthetic pathways and biological activity. The structural and activity information can help in function prediction and rational design of drug candidates or guide the screening for specific targets. The genetic information can be used in mining genomes for discovering new compounds and predicting products for cryptic biosynthetic gene clusters. Probable applications lie also in the emerging fields of combinatory biosynthesis and synthetic biology to produce engineered compounds in biological systems.Syanobakteerit, eli sinilevät, tuottavat monenlaisia myrkkyjä ja muita biologisesti aktiivisia luonnonyhdisteitä. Luonnonyhdisteitä tuottavat organismit pyrkivät niiden avulla vuorovaikutukseen ympäristönsä kanssa esimerkiksi suojautuakseen saalistajilta, kilpailijoilta tai elottomilta tekijöiltä kuten säteilyltä. Näiden yhdisteiden tuottamiseen tarvittava geneettinen informaatio on tavallisesti koodattu biosynteettisiin geeniryppäisiin, jotka tuottavat useita entsyymejä yhdisteen kokoamiseksi. Yleisimpien syanobakteerien tuottamien myrkkyjen ja yhdisteiden rakenteet ja biosynteesireitit on selvitetty, mutta uusia yhdisteitä ja niiden geneettistä alkuperää kuvataan jatkuvasti. Syanobakteerien tuottamissa luonnonyhdisteissä nähdään potentiaalia lääketeollisuudessa. Erilaisten tartuntatautien ja syöpien hoitotarpeen kasvaessa ja mikrobilääkeresistenssin yleistyessä etsitään uusia lääkkeitä. Syanobakteerien tuottamien yhdisteiden monimuotoisuudessa nähdään potentiaalia lääkekehityksessä tarvittavien johtolankamolekyylien löytämiseen. Tämän tutkimuksen päämääränä oli löytää syanobakteereista uusia johtolankamolekyylejä ja kuvata näiden rakenne, biologinen aktiivisuus ja biosynteettinen alkuperä. Löysin uusia laksafysiini-perheen yhdisteitä bakteereista Nostoc sp. UHCC 0702 ja Scytonema hofmannii PCC 7110. Laksafysiinit ovat joukko syanobakteerien tuottamia luonnonyhdisteitä, joilla on sienten ja syöpäsolulinjojen kasvua estäviä ominaisuuksia. Laksafysiinit ovat makrosyklisiä lipopeptidejä, jotka jaetaan kahteen rakenteellisesti eroavaan ryhmään, 11- ja 12-aminohapon ryhmiin. Näiden ryhmien välillä on vahva synergistinen muiden organismien kasvua estävä vaikutus. Tässä tutkimuksessa laksafysiinien biosynteesireitti kuvataan ensimmäistä kertaa. Laksafysiinien tuotanto tapahtuu haarautuvalla biosynteesireitillä, jossa biosynteesin käynnistävät entsyymit osallistuvat molempien yhdisteryhmien tuotantoon. Biosynteettinen geenirypäs kuvattiin molemmista tutkituista laksafysiinejä tuottaneista bakteerikannoista. Uusi ryhmä laksafysiinien rakenteellisia variantteja löydettiin: heinamidit. Heinamideilla on ennennäkemättömiä rakenteellisia ominaisuuksia, joiden alkuperälle esitän ennusteet. Uudet variantit estävät sienten kasvua synergisesti, kuten aiemmin kuvatut laksafysiinit. 11-ja 12-aminohappotähteen yhdisteiden yhteisvaikutus linkittyy mielenkiintoisesti perimätasolla, kun yhdisteet jakavat osan biosynteesireiteistään. Aeruginosiinit ovat yleisiä syanobakteerien tuottamia tetrapeptidejä, joilla on trypsiinin kaltaisia entsyymejä inhiboiva vaikutus. Trypsiiniä on viime aikoina tutkittu mahdollisena lääkeaineiden kohteena syöpähoidoissa. Tässä työssä löysimme uusia aeruginosiinien rakenteellisia variantteja, jotka nimesimme pseudospumigiineiksi. Pseudospumigiinit löydettiin bakteerikannasta Nostoc sp. CENA 543. Pseudospumigiinit tuotetaan bakteerisolussa PKS/NRPS biosynteesireittiä pitkin, joka muistuttaa aeruginosiinien biosynteesiä. Pseudospumigiini A toimii trypsiini-inhibiittorina, jonka aikariippuvainen IC50 arvo on 4,5 μM. Myös Nodulariini-R maksamyrkkyä löydettiin samasta bakteerikannasta. Kannan nodulariinipitoisuus oli paljon suurempi, kuin Nostoc suvun bakteereista on aiemmin löydetty ja verrattavissa yleisimpien nodulariinituottajien, Nodularia spumigena -lajin bakteerien, tuottamiin pitoisuuksiin. Tämä väitöskirja kuvaa uusia syanobakteerien tuottamia luonnonyhdisteitä, niiden biologista aktiivisuutta ja niiden biosynteesireitit, laajentaen ymmärtämystämme luonnonyhdisteiden mahdollisuuksista. Tieto yhdisteiden uusista kemiallisista rakenteista ja niiden bioaktiivisuudesta voi auttaa lääkeyhdisteiden rationaalista suunnittelua tai ohjata johtolankamolekyylien seulontaa tarkempiin kohteisiin. Tiedon avulla voimme myös tehdä parempia tulkintoja siitä, mitä hyötyä yhdisteistä on niitä tuottaville bakteereille. Geneettistä tietoa voidaan käyttää geenilouhintaan uusia yhdisteitä etsittäessä ja tuntemattomien biosynteettisten geeniryppäiden tuotteiden ennustamiseen. Todennäköisesti tietoa tullaan myös käyttämään synteettisen biologian ja kombinatoriaalisen biosynteesin kasvavilla aloilla suunniteltujen yhdisteiden tuottamiseen muunnelluissa organismeissa