Protein kinases that phosphorylates histone H3

Στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου εντοπίζονται ένζυμα που τροποποιούν τις πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης όπως είναι η κινάση του LBR. Τα τελευταία χρόνια στα στοιχεία του πυρηνικού φακέλου έχει προστεθεί και η περιφερική ετεροχρωματίνη. Η ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) αποτελεί κύριο καταστολέα του φαινομένου επίδρασης θέσης και ενέχεται στη δημιουργία και διατήρηση της δομής της χρωματίνης. Παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου μας, έχουν δείξει ότι η ΗΡ1 συνδέεται στον πυρηνικό φάκελο. Η σύνδεση αυτή πραγματοποιείται μέσω του σχηματισμού συμπλόκου ανάμεσα στον LBR τις νουκλεοσωμικές ιστόνες Η3/Η4 και την ΗΡ1.Η ΗΡ1 συνδέεται με ένζυμα όπως η μεθυλοτρανσφεράση Suvar 3-9, η οποία μεθυλιώνει την ιστόνη Η3 στη λυσίνη 9. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω θεωρήσαμε ενδιαφέρον να διερευνήσουμε την ύπαρξη πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν ιστόνες της ετεροχρωματίνης που συνδέονται με τον πυρηνικό φάκελο. Χρησιμοποιώντας την μέθοδο συγκατακρίμνησης πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης (GST pull-down) διαπιστώσαμε ότι μαζί με την ανασυνδιασμένη Μ31 (ΗΡ1β) συγκατακριμνίζεται εκτός από τις νουκλεοσωμικές ιστόνες και μια κινάση που φωσφορυλιώνει την Η3 στη θρεονίνη 3. Η κινάση συνδέεται με την Μ31 και όχι με τα νουκλεοσώματα. Για να μελετήσουμε την ύπαρξη και κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 παράγαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει την συγκεκριμένη τροποποίηση. Το αντίσωμα χαρακτηρίστηκε ως προς την ικανότητα του να αναγνωρίζει ειδικά τη φωσφορυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 με ELISA, ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση. Δείξαμε την ύπαρξη της συγκεκριμένης τροποποίησης in vivo η οποία ανιχνεύθηκε σε όλες τις καρκινικές σειρές (τραχήλου της μήτρας, μαστού, προστάτη, λευχαιμικές) που εξετάσαμε καθώς και σε φυσιολογικά κύτταρα (πολυδύναμα μεσεγχυματικά και μυελού των οστών, ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα ποντικού). Η κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 είναι παρόμοια για όλα τα είδη κυττάρων που μελετήσαμε.Όπως οι περισσότερες φωσφρορυλιώσεις των ιστονών έτσι και η συγκεκριμένη εντοπίζεται στη μίτωση. Η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 αρχίζει στην πρόφαση και σταματάει να υφίσταται στο τέλος της ανάφασης. Κατά την πρόφαση εντοπίζεται γύρω από τον πυρηνικό φάκελο ενώ συνεχίζοντας στην προμετάφαση-μετάφαση παρατηρείται σε κεντρικές περιοχές των χρωμοσωμάτων καθώς και κατά μήκος των χρωμοσωμάτων. Τέλος κατά στην αρχή της ανάφασης ανιχνεύεται στα άκρα των χρωμοσωμάτων, ενώ δεν εντοπίζεται στην τελόφαση.Η καλύτερα μελετημένη φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 είναι η φωσφορυλίωση στην σερίνη 10. Σύγκριση των δύο τροποποιήσεων έδειξε διαφορές στην κατανομή τους. Αναλυτικότερα, η φωσφορυλίωση στη σερίνη 10 αρχίζει στη μεσόφαση (G2) και συνεχίζεται μέχρι το τέλος της μίτωσης όπου ανιχνεύεται στην περιφέρεια των νεοσχηματιζόμενων πυρήνων ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 απουσιάζει τόσο κατά τη μεσόφαση όσο και στην τελόφαση. Στην πρόφαση τα δυο σήματα εντοπίζονται στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου ενώ κατά τη μετάφαση διαχωρίζονται, με τη φωσροφυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 να εντοπίζεται κατά μήκος των χρωμοσωμάτων και κυρίως στα κεντρομερή Από τα μέχρι τώρα διαθέσιμα αποτελέσματα υπάρχουν σοβαρές ενδείξεις ότι το ένζυμο που φωσφορυλιώνει την ιστόνη Η3 στη θρεονίνη 3 συνδέεται ισχυρά με περιφερικές δομές του πυρήνα των κυττάρων. Συγκεκριμένα, πειράματα ανοσοφθορισμού που πραγματοποιήσαμε έδειξαν ότι κατά τα πρώιμα στάδια της πρόφασης, η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 της Η3, αρχίζει ξεκάθαρα, από την περιοχή του πυρηνικού φακέλου. Επίσης η ενεργότητα της συγκεκριμένης κινάσης αρχικά, ανιχνεύθηκε σε παρασκευάσματα μεγάλης καθαρότητας, πυρηνικών φακέλων με περιφερική ετεροχρωματίνη, ενώ από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι η κινάση συνδέεται με την ΗΡ1 η οποία αλληλεπιδρά μέσω των ιστονών με τον LBR και κατ’ επέκταση με τον πυρηνικό φάκελο

Epithelial/Mesenchymal Characteristics and PD-L1 Co-Expression in CTCs of Metastatic Breast Cancer Patients Treated with Eribulin: Correlation with Clinical Outcome

We aimed to evaluate the co-expression of PD-L1 and epithelial-mesenchymal markers in CTCs from metastatic breast cancer (MBC) patients and to determine if there is any relationship with patients’ outcome after eribulin treatment. Using cytospin preparations of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from MBC patients treated with eribulin and a combination of immunocytochemistry and immunofluorescence, we quantified PD-L1, keratins and vimentin in single and cluster CTCs on days 1 and 8 of the first-treatment cycle. CTCs (n = 173) were found in 31 out of 38 patients. At baseline, the presence of cluster CTCs (p = 0.048), cluster mesenchymal CTCs (mCTCs) (p = 0.0003) or cluster PD-L1+mCTCs (p = 0.006) was associated with shorter overall survival (OS). In multivariate cox regression analysis, the detection of cluster mCTCs was the only parameter associated with increased risk of death (p = 0.024). On day 8 post-eribulin administration, PD-L1+mCTCs and especially single PD-L1+mCTCs decreased in 75% and 89% of patients, respectively. The detection of single PD-L1+mCTCs after eribulin treatment was correlated with shorter PFS (p = 0.047) and OS (p = 0.020). In conclusion, our study identified for the first time that cluster and single PD-L1+mCTCs subpopulations are of clinical significance in patients with MBC and highlighted the importance of CTC phenotyping during treatment with eribulin

Glycosylation Modulates Plasma Membrane Trafficking of CD24 in Breast Cancer Cells

In breast cancer, expression of Cluster of Differentiation 24 (CD24), a small GPI-anchored glycoprotein at the cell periphery, is associated with metastasis and immune escape, while its absence is associated with tumor-initiating capacity. Since the mechanism of CD24 sorting is unknown, we investigated the role of glycosylation in the subcellular localization of CD24. Expression and localization of wild type N36- and/or N52-mutated CD24 were analyzed using immunofluorescence in luminal (MCF-7) and basal B (MDA-MB-231 and Hs578T) breast cancer cells lines, as well as HEK293T cells. Endogenous and exogenously expressed wild type and mutated CD24 were found localized at the plasma membrane and the cytoplasm, but not the nucleoplasm. The cell lines showed different kinetics for the sorting of CD24 through the secretory/endocytic pathway. N-glycosylation, especially at N52, and its processing in the Golgi were critical for the sorting and expression of CD24 at the plasma membrane of HEK293T and basal B type cells, but not of MCF-7 cells. In conclusion, our study highlights the contribution of N-glycosylation for the subcellular localization of CD24. Aberrant N-glycosylation at N52 of CD24 could account for the lack of CD24 expression at the cell surface of basal B breast cancer cells

Histones H3/H4 form a tight complex with the inner nuclear membrane protein LBR and heterochromatin protein 1

We have recently shown that heterochromatin protein 1 (HP1) interacts with the nuclear envelope in an acetylation-dependent manner. Using purified components and in vitro assays, we now demonstrate that HP1 forms a quaternary complex with the inner nuclear membrane protein LBR and a sub-set of core histones. This complex involves histone H3/H4 oligomers, which mediate binding of LBR to HP1 and cross-link these two proteins that do not interact directly with each other. Consistent with previous observations, HP1 and LBR binding to core histones is strongly inhibited when H3/H4 are modified by recombinant CREB-binding protein, revealing a new mechanism for anchoring domains of under-acetylated chromatin to the inner nuclear membrane

Optimized detection of circulating anti-nuclear envelope autoantibodies by immunofluorescence

Abstract Background Antinuclear antibodies are useful diagnostic tools in several autoimmune diseases. However, the routine detection of nuclear envelope autoantibodies using immunofluorescence (IF) is not always easy to perform in patients' sera because of the presence of autoantibodies to other nuclear and cytoplasmic components which could mask the characteristic rim-like pattern of nuclear envelope autoantibodies. This is particularly common in sera from patients with primary biliary cirrhosis (PBC), which generaly have high titres of anti-mitochondrial antibodies. Therefore, we have assayed a number of commercial slides and alternative fixation conditions to optimize the detection of anti-nuclear envelope antibodies (ANEA) in PBC sera. Methods We have explored the presence of ANEA in 33 sera from patients with established PBC using three different Hep2 commercial slides and home-made slides with HeLa and Hep2 cells fixed with methanol, ethanol, 1% or 4% formaldehyde. Results We observed that the IF pattern was related to the cell type used (Hep2 or HeLa), the manufacturer and the cell fixation scheme. When both cell lines were fixed with 1% formaldehyde, the intensity of the cytoplasmic staining was considerably decreased regardless to the serum sample, whereas the prevalence of cytoplasmic autoantibodies was significantly lowered, as compared to any of the Hep2 commercial slide and fixation used. In addition, the prevalence of ANEA was importantly increased in formaldehyde-fixed cells. Conclusion Immunofluorescence using appropriately fixed cells represent an easy, no time-consuming and low cost technique for the routine screening of sera for ANEA. Detection of ANEA is shown to be more efficient using formaldehyde-fixed cells instead of commercially available Hep2 cells.</p

Differential detection of nuclear envelope autoantibodies in primary biliary cirrhosis using routine and alternative methods

Abstract Background Detection of autoantibodies giving nuclear rim pattern by immunofluorescence (anti-nuclear envelope antibodies - ANEA) in sera from patients with primary biliary cirrhosis (PBC) is a useful tool for the diagnosis and prognosis of the disease. Differences in the prevalence of ANEA in PBC sera so far reported have been attributed to the methodology used for the detection as well as to ethnic/geographical variations. Therefore, we evaluated the prevalence of ANEA in sera of Greek patients with PBC by using methods widely used by clinical laboratories and a combination of techniques and materials. Methods We screened 103 sera by immunoblotting on nuclear envelopes and indirect immunofluorescence (IIF) using cells and purified nuclei. Reactivities against specific autoantigens were assessed using purified proteins, ELISA, immunoprecipitation and mass spectrometry. Results We found higher prevalence of ANEA when sera were assayed by IIF on purified nuclei or cultured cells (50%) compared to Hep2 commercially available slides (15%). Anti-gp210 antibodies were identified in 22.3% and 33% of sera using ELISA for the C-terminal of gp210 or both ELISA and immunoprecipitation, respectively. Immunoblotting on nuclear envelopes revealed that immunoreactivity for the 210 kDa zone is related to anti-gp210 antibodies (p Conclusions The prevalence of ANEA or anti-gp210 antibodies is under-estimated in PBC sera which are analyzed by conventional commercially available IIF or ELISA, respectively. Therefore, new substrates for IIF and ELISA should be included by clinical laboratories in the analysis of ANEA in autoimmune sera.</p