Uso de biomarcadores hitológicos e bioquímicos na análise da toxicidade do cloreto de cobre em Jundiás (Rhamdia quelen)

Orientador: Helena Cristina da Silva de AssisCoorientador: Izonete Cristina GuiloskiMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : O cloreto de cobre (CuCl2. 2H2O) é uma substância amplamente utilizada como desinfetante, desodorante e dessulfurizante em destilados de petróleo, na purificação de água, como aditivo alimentar e principalmente, como biocida. O jundiá Rhamdia quelen, organismo bioindicador do presente trabalho, é um peixe de distribuição neotropical encontrado em rios paranaenses. O cultivo dessa espécie vem aumentando nos últimos anos devido sua boa aceitação pelo mercado consumidor. O uso de biomarcadores possibilita avaliar o efeito causado por diferentes contaminantes, como o cobre, nos seres vivos. Eles podem ser definidos como respostas biológicas adaptativas a estressores, evidenciadas como alterações bioquímicas, celulares, histológicas fisiológicas ou comportamentais. Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do cloreto de cobre em jundiás (Rhamdia quelen) utilizando biomarcadores histológicos e bioquímicos por meio de um bioensaio estático. Os peixes (n=80) foram distribuídos em grupos controle e teste, sendo expostos por 96 horas às concentrações de 2 µg/L, 10 µg/L e 20 µg/L de cloreto de cobre. Em fígado, os parâmetros analisados foram a histopatologia e as atividades enzimáticas: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa Stransferase (GST) e glutationa redutase (GR), além da peroxidação de lipídica (LPO). A análise da atividade da acetilcolinesterase (AChE) foi realizada em músculo e cérebro. Os resultados obtidos permitiram concluir que o cloreto de cobre é tóxico para a espécie principalmente, nas concentrações de 10 µg/L e 20 µg/L. A atividade da SOD e a análise histopatológica com a presença de centros de melanomacrófagos (CMM) podem ser utilizados como biomarcadores para a exposição ao cloreto de cobre, pois foram os que mais responderam

Investigação da existência de ritmicidade circadiana de enzimas antioxidantes em Zebrafish (Danio rerio) e sua desregulação à exposição ao cobre

Orientador : Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira RandiCo-orientador : Prof. Dr. Nicholas Simon FoulkesTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 26/02/2018Inclui referênciasResumo: Todos os seres vivos possuem um sistema marcador de tempo que é sincronizável com o ambiente onde vivem. À vista disso, uma estreita ligação entre o ritmo circadiano e processos fisiológicos relacionados à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de enzimas antioxidantes é relatada em diversos organismos. Por sua vez, o sulfato de cobre (CuSO4) é um composto conhecidamente pró-oxidante e amplamente utilizado em aquicultura como agente terapêutico em peixes. Ele é frequentemente utilizado em concentrações que chegam a ser de sete até cem vezes maiores do que as encontradas em ambientes com influência de atividades antrópicas. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico do sulfato de cobre em diversos organismos aquáticos, a investigação das consequências da exposição a esse metal, e consequente promoção de estresse oxidativo, no ritmo circadiano ainda não foi examinada. Nesta tese, foi avaliado o efeito e possíveis mecanismos moleculares envolvidos na resposta celular das defesas antioxidantes e de proteínas chaves envolvidas na marcação da ritmicidade circadiana em peixes Danio rerio e na linhagem celular derivada de embriões da mesma espécie (PAC-2) expostos ao CuSO4. No primeiro capítulo, estudos bioquímicos e de expressão gênica, juntamente com análises químicas indicaram que a exposição hídrica ao CuSO4 interferiu com a coordenação entre as enzimas SOD e CAT e perturbou a oscilação diária de proteínas de controle do relógio. Ainda, evidências concretas sobre a existência de ritmicidade na expressão e atividade de SOD e CAT foram encontradas. Estes resultados indicaram que a sincronização do organismo com o ambiente pode ser prejudicada devido à exposição aguda ao sulfato de cobre. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar de maneira mais aprofundada as bases moleculares do cross-talk entre o cobre, as enzimas antioxidantes SOD e CAT e o relógio circadiano. Com a utilização de técnicas de clonagem molecular, transfecções e quantificação de expressão gênica, os resultados obtidos apoiam fortemente uma relação entre exposição aguda ao Cu, ativação da defesa antioxidante e distúrbios na expressão de genes envolvidos no controle do relógio circadiano através da ativação da via de sinalização da MAPK em células PAC-2. Além disso, também foi demonstrado que a transcrição da SOD pode ser regulada tanto em resposta ao estresse oxidativo como também associada ao relógio circadiano. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre exposição ao Cu e desregulação do mecanismo de controle do relógio circadiano em organismos aquáticos. Palavras chave: zebrafish, sulfato de cobre, defesa antioxidante, ritmicidade circadianoAbstract: All living beings present a time-marking system that can synchronize with the environment where they live. A close link between the circadian rhythm and physiological processes related to the production of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes is reported in several organisms. Copper sulfate (CuSO4), in turn, is a compound known as pro-oxidant and widely used in aquaculture as a therapeutic agent in fish. It is frequently applied in concentrations between seven to one hundred times greater than as found in environments with influence of anthropic activities. Although many studies have demonstrated the toxic potential of copper ions in various aquatic organisms, an investigation of the consequences of CuSO4 exposure, consequent promotion of oxidative stress, and the circadian rhythm has not yet been examined. In this thesis, we evaluated the effect and possible molecular mechanisms involved in the cellular response of antioxidant defenses and key proteins involved in circadian rhythm in Danio rerio and in the cell line, PAC-2, derived from embryos of the same species, exposed to CuSO4. In the first chapter, biochemical and gene expression studies along with chemical analyzes indicated that exposure to CuSO4 interfered with the coordination between SOD and CAT enzymes and disrupted the daily oscillation of circadian rhythm control proteins. Moreover, concrete evidence on the existence of rhythmicity in the expression and activity of SOD and CAT were found. These results indicated that a synchronization of the organism with the environment may be impaired due to acute exposure to Cu. In this way, the second chapter was conducted in order to explore the molecular bases of the cross-talk between copper, SOD and CAT antioxidant enzymes and the circadian clock. With the use of molecular cloning techniques, transfections and gene expression, the results obtained support a relationship between Cu exposure, activation of the antioxidant defense and disorders in the expression of circadian clock control genes through the activation of the MAPK pathway in PAC-2. It has also been shown that the transcription of SOD can be regulated both as a response to oxidative stress and also associated with the circadian clock. In general, this study provides the first information about the toxicological interaction between Cu exposure and deregulation of the circadian clock control mechanism in aquatic organisms. Key words: zebrafish, copper sulfate, antioxidant defense, circadian rhyth

Os projetos de MDL de reflorestamento/florestamento : uma análise das perspectivas para o território brasileiro

Orientadora: Profª. Drª. Anna Paula Dalla CorteMonografia (especialização) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Curso de Especialização em Projetos Sustentáveis, Mudanças Climáticas e Mercado de CarbonoInclui referênciasResumo: Desde a década de 80 a preocupação com o meio ambiente aumentou e enfatizou a necessidade da produção sustentável. Nesse contexto, surgiu a proposta da redução dos impactos ambientais causados pelas atividades antropogênicas, em especial, a redução das emissões de gases efeito estufa que potencializam as mudanças climáticas. Assim, o Protocolo de Quioto veio para vincular legalmente os países que se comprometeram a diminuir suas emissões de gases efeito estufa. Ele prevê três mecanismos para que os países cumpram as metas a que se comprometeram, porém apenas o Mecanismo do Desenvolvimento Limpo (MDL) permite a participação de países em desenvolvimento como o Brasil. Assim, o presente artigo objetiva uma refinada análise da situação brasileira dentro do desenvolvimento sustentável promovido por projetos de MDL. Além disso, analisará mais profundamente o escopo de reflorestamento/florestamento (A/R – do inglês afforestation and reforestation), no qual o Brasil apresenta grande potencial ainda não explorado principalmente na questão do desenvolvimento de projetos de pequena escala por pequenos produtores rurais

Avaliação preliminar da qualidade de água dos reservatórios de alagados e vossoroca com o uso de biomarcadores de contaminação

Orientador : Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira RandiCo-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto De Oliveira RibeiroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2014Inclui referências : f. 67-80Área de concentração: Biologia celular e molecularResumo: Os reservatórios de Alagados e Vossoroca são considerados moderadamente poluídos, pelo Instituto Ambiental do Estado do Paraná (IAP), com base apenas em parâmetros físico-químicos da água. Sabe-se que apenas análises químicas podem não ser suficientes para caracterizar efeitos adversos de misturas complexas dos xenobióticos em ambientes aquáticos. Dessa forma, nesse estudo utilizou-se determinação dos níveis de metais na água e no sedimento e avaliação de saúde de uma espécie de peixe nativa (Geophagus brasiliensis) com o uso de diversos biomarcadores para avaliar a qualidade da água e avaliar a saúde da fauna aquática. Indivíduos de Geophagus brasiliensis foram capturados em um ponto de amostragem no reservatório de Vossoroca (VOS) e em três locais distintos do reservatório de Alagados (AL - A, AL - B, AL - C), visando a identificar diferentes tipos de poluição, domestica e agrícola, do ambiente em estudo. Sangue, músculo, cérebro, fígado e brânquias foram coletados para análises bioquímicas (AchE, GST, GSH, SOD, CAT, PCO e LPO), análises morfológicas (microscopia eletrônica de varredura e microscopia de luz) e análise de desregulação endócrina em machos. Água e sedimentos foram coletados para análise dos níveis de metais em espectrometria de absorção atômica (FAAS). Embora não tenham sido encontradas diferenças nas frequências relacionadas às alterações morfológicas nas brânquias entre os dois reservatórios, Vossoroca apresentou menor concentração de todos os metais analisados e índice de lesão menor na análise histopatológica do fígado quando comparado com Alagados. Os valores encontrados nos peixes coletados em Vossoroca para a atividade SOD e níveis de GSH em G. brasiliensis foram semelhantes a resultados encontrados em áreas não poluídas. Alagados apresentou todas as concentrações de metais, exceto para Co e de Zn, acima do limite legal em pelo menos um dos pontos analisados. Além disso, o ponto AL - A indica ser mais impactado por atividades antrópicas, já que tem maior concentração de Cu, Mn, Co e Al na coluna d'água e maiores atividades de SOD e CAT no fígado, em comparação com os outros locais analisados no mesmo reservatório. Não foi detectada desregulação endócrina em machos coletados em Alagados. De acordo com os resultados apresentados, no presente estudo são expostas contribuições importantes para melhorar o conhecimento sobre a resposta ao estresse para a espécie nativa Geophagus brasiliensis. Os melhores biomarcadores para a avaliação dos danos causados pela exposição crônica a xenobióticos, especialmente metais, foram a atividade da AchE muscular e cerebral, avaliação histopatológica do fígado e contagem de centros de melanomacrófagos. Palavras-chave: Geophagus brasiliensis, bioacumulação, bioconcentração, metais tóxicos, reservatórios.Abstract: Alagados and Vossoroca reservoirs are considered moderately polluted, by the environmental agency of the State of Paraná, based only on physical-chemical parameters of water. Regarding that chemical analysis alone may not be enough to describe adverse effects of complex mixtures of chemicals in aquatic environments, in this study we employed the determination of metal levels in water and sediment and health evaluation of a native fish species (Geophagus brasiliensis) through a multi biomarker approach to assess water quality and evaluate health of the aquatic fauna. Individuals of Geophagus brasiliensis were captured at one sampling point in Vossoroca (VOS) and at three distinct locals of Alagados (AL - A, AL - B, AL - C) aiming at a variety of environmental influence levels. Blood, muscle, brain, liver and gills were collected to biochemical (AchE, GST, GSH, SOD, CAT, PCO and LPO), morphological (light microscopy and scanning electron microscopy) and endocrine disrupting analyses. Water and sediment were collected for metal levels analysis in flame atomic absorption spectrometry (FAAS). Although no differences in frequencies related to the morphological changes in gills were found between the two reservoirs, smaller concentration of all metals analyzed and smaller lesion index in histopathological analysis of liver were observed in VOS when compared to Alagados reservoir. SOD activity and GSH levels in G. brasiliensis in VOS were similar to results observed in non-polluted areas. Alagados exhibited all metal levels, except for Co and Zn concentrations, above the legal limit in at least one of the points analyzed. In addition, AL - A indicated to be more impacted by anthropogenic activities, as it has higher concentration of Cu, Mn, Co and Al in water column and higher activities of SOD and CAT in liver compared to the other analyzed sites. No endocrine disruption was detected in males from Alagados reservoir. According to the present results, this work has important contributions to improve knowledge about the response to stressors presenting (performed by/shown by) Geophagus brasiliensis species. The best biomarkers for the assessment of damage caused by chronic exposure to xenobiotics, especially metals, were the activity of AChE in muscle and brain, histopathological evaluation of liver and counting of melanomacrophage centers. Keywords: Geophagus brasiliensis, bioaccumulation, bioconcentration, toxic metals, reservoirs

Avaliação preliminar da qualidade de água dos reservatórios de alagados e vossoroca com o uso de biomarcadores de contaminação

Orientador : Prof. Dr. Marco Antonio Ferreira RandiCo-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto De Oliveira RibeiroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2014Inclui referências : f. 67-80Área de concentração: Biologia celular e molecularResumo: Os reservatórios de Alagados e Vossoroca são considerados moderadamente poluídos, pelo Instituto Ambiental do Estado do Paraná (IAP), com base apenas em parâmetros físico-químicos da água. Sabe-se que apenas análises químicas podem não ser suficientes para caracterizar efeitos adversos de misturas complexas dos xenobióticos em ambientes aquáticos. Dessa forma, nesse estudo utilizou-se determinação dos níveis de metais na água e no sedimento e avaliação de saúde de uma espécie de peixe nativa (Geophagus brasiliensis) com o uso de diversos biomarcadores para avaliar a qualidade da água e avaliar a saúde da fauna aquática. Indivíduos de Geophagus brasiliensis foram capturados em um ponto de amostragem no reservatório de Vossoroca (VOS) e em três locais distintos do reservatório de Alagados (AL - A, AL - B, AL - C), visando a identificar diferentes tipos de poluição, domestica e agrícola, do ambiente em estudo. Sangue, músculo, cérebro, fígado e brânquias foram coletados para análises bioquímicas (AchE, GST, GSH, SOD, CAT, PCO e LPO), análises morfológicas (microscopia eletrônica de varredura e microscopia de luz) e análise de desregulação endócrina em machos. Água e sedimentos foram coletados para análise dos níveis de metais em espectrometria de absorção atômica (FAAS). Embora não tenham sido encontradas diferenças nas frequências relacionadas às alterações morfológicas nas brânquias entre os dois reservatórios, Vossoroca apresentou menor concentração de todos os metais analisados e índice de lesão menor na análise histopatológica do fígado quando comparado com Alagados. Os valores encontrados nos peixes coletados em Vossoroca para a atividade SOD e níveis de GSH em G. brasiliensis foram semelhantes a resultados encontrados em áreas não poluídas. Alagados apresentou todas as concentrações de metais, exceto para Co e de Zn, acima do limite legal em pelo menos um dos pontos analisados. Além disso, o ponto AL - A indica ser mais impactado por atividades antrópicas, já que tem maior concentração de Cu, Mn, Co e Al na coluna d'água e maiores atividades de SOD e CAT no fígado, em comparação com os outros locais analisados no mesmo reservatório. Não foi detectada desregulação endócrina em machos coletados em Alagados. De acordo com os resultados apresentados, no presente estudo são expostas contribuições importantes para melhorar o conhecimento sobre a resposta ao estresse para a espécie nativa Geophagus brasiliensis. Os melhores biomarcadores para a avaliação dos danos causados pela exposição crônica a xenobióticos, especialmente metais, foram a atividade da AchE muscular e cerebral, avaliação histopatológica do fígado e contagem de centros de melanomacrófagos. Palavras-chave: Geophagus brasiliensis, bioacumulação, bioconcentração, metais tóxicos, reservatórios.Abstract: Alagados and Vossoroca reservoirs are considered moderately polluted, by the environmental agency of the State of Paraná, based only on physical-chemical parameters of water. Regarding that chemical analysis alone may not be enough to describe adverse effects of complex mixtures of chemicals in aquatic environments, in this study we employed the determination of metal levels in water and sediment and health evaluation of a native fish species (Geophagus brasiliensis) through a multi biomarker approach to assess water quality and evaluate health of the aquatic fauna. Individuals of Geophagus brasiliensis were captured at one sampling point in Vossoroca (VOS) and at three distinct locals of Alagados (AL - A, AL - B, AL - C) aiming at a variety of environmental influence levels. Blood, muscle, brain, liver and gills were collected to biochemical (AchE, GST, GSH, SOD, CAT, PCO and LPO), morphological (light microscopy and scanning electron microscopy) and endocrine disrupting analyses. Water and sediment were collected for metal levels analysis in flame atomic absorption spectrometry (FAAS). Although no differences in frequencies related to the morphological changes in gills were found between the two reservoirs, smaller concentration of all metals analyzed and smaller lesion index in histopathological analysis of liver were observed in VOS when compared to Alagados reservoir. SOD activity and GSH levels in G. brasiliensis in VOS were similar to results observed in non-polluted areas. Alagados exhibited all metal levels, except for Co and Zn concentrations, above the legal limit in at least one of the points analyzed. In addition, AL - A indicated to be more impacted by anthropogenic activities, as it has higher concentration of Cu, Mn, Co and Al in water column and higher activities of SOD and CAT in liver compared to the other analyzed sites. No endocrine disruption was detected in males from Alagados reservoir. According to the present results, this work has important contributions to improve knowledge about the response to stressors presenting (performed by/shown by) Geophagus brasiliensis species. The best biomarkers for the assessment of damage caused by chronic exposure to xenobiotics, especially metals, were the activity of AChE in muscle and brain, histopathological evaluation of liver and counting of melanomacrophage centers. Keywords: Geophagus brasiliensis, bioaccumulation, bioconcentration, toxic metals, reservoirs

Measuring mutagenicity in ecotoxicology: A case study of Cd exposure in Chironomus riparius

Existing mutagenicity tests for metazoans lack the direct observation of enhanced germline mutation rates after exposure to anthropogenic substances, therefore being inefficient. Cadmium (Cd) is a metal described as a mutagen in mammalian cells and listed as a group 1 carcinogenic and mutagenic substance. But Cd mutagenesis mechanism is not yet clear. Therefore, in the present study, we propose a method coupling short-term mutation accumulation (MA) lines with subsequent whole genome sequencing (WGS) and a dedicated data analysis pipeline to investigate if chronic Cd exposure on Chironomus riparius can alter the rate at which de novo point mutations appear. Results show that Cd exposure did not affect the basal germline mutation rate nor the mutational spectrum in C. riparius, thereby arguing that exposed organisms might experience a range of other toxic effects before any mutagenic effect may occur. We show that it is possible to establish a practical and easily implemented pipeline to rapidly detect germ cell mutagens in a metazoan test organism. Furthermore, our data implicate that it is questionable to transfer mutagenicity assessments based on in vitro methods to complex metazoans. (C) 2020 Elsevier Ltd. All rights reserved

A multigenerational study can detect the evolutionary response to BaP exposure in the non-biting freshwater midge Chironomus riparius

Highlights • BaP exposure increases the mutation rate of C. riparius. • BaP exposure is detrimental for the fitness and the population dynamics of C. riparius. • Multi-generational studies are essential to assess evolutionary implications of anthropogenic substances on biodiversity. Abstract The release of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) into the environment is posing a threat to ecosystems and human health. Benzo(a)pyrene (BaP) is considered a biomarker of PAH exposure and is classified as a Group 1 carcinogen. However, it was not known whether BaP is mutagenic, i.e. induces inherited germline mutations. In this study, we used a recently established method, which combines short-term mutation accumulation lines (MAL) with whole genome sequencing (WGS) to assess mutagenicity in the non-biting midge Chironomus riparius. The mutagenicity analysis was supplemented by an evaluation of the development of population fitness in three successive generations in the case of chronic exposure to BaP at a high concentration (100 μg/L). In addition, the level of ROS-induced oxidative stress was examined in vivo. Exposure to the higher BaP concentration led to an increase in germline mutations relative to the control, while the lower concentration showed no mentionable effect. Against expectations, BaP exposure decreased ROS-level compared to the control and is thus probably not responsible for the increased mutation rate. Likewise, the higher BaP concentration decreased fitness measured as population growth rate per day (PGR) significantly over all generations, without signs of rapid evolutionary adaptations. Our results thus highlighted that high BaP exposure may influence the evolutionary trajectory of organisms

Metal pollution assessment in a Brazilian hydroelectric reservoir: Geophagus brasiliensis as a suitable bioindicator organism

Vossoroca is a reservoir in the Brazilian state of Paraná. Although it is located near big cities and can be used as a human water supply, it has remained unstudied. Concentrations of toxic metals and arsenic in sediments, water, liver, gills, and muscle of Geophagus brasiliensis from the reservoir were analyzed using atomic absorption spectrometry. Histological analyses were performed on the gills and the livers using scanning electron microscopy and light microscopy, respectively. The results showed that Vossoroca sediments were moderately polluted by copper, chromium, nickel and arsenic. Cadmium was above legal limits in the water. Histopathological assessment revealed epithelial alterations in the secondary lamella to be the most common abnormality observed in the gills and necrosis, melanomacrophage centers in the livers. In conclusion, although the reservoir is located in an Environmental Protection Area, it is negatively affected by human activity. Further, Geophagus brasiliensis was a suitable bioindicator for metal pollution studies