Aplicación de técnicas moleculares al estudio de la vida útil de filetes de merluza conservados en atmósferas modificadas

El pescado es un producto esencial en la dieta de gran parte de la población mundial y por tanto de gran interés económico. En los últimos años sus canales de distribución han evolucionado estimulando el desarrollo de nuevos métodos de conservación para prolongar su vida útil y de nuevos sistemas para la estimación de su vida útil que ayuden a optimizar su gestión y comercialización. El desarrollo de estos últimos es posible mediante el uso de modelos de predicción del crecimiento microbiano, sin embargo es necesaria una cuantificación rápida y efectiva de los mismos, y más específicamente de los microorganismos responsables de la alteración, que en el caso de la merluza es, principalmente, P. phosphoreum. Las técnicas moleculares, en concreto la qPCR, podría suplir a la microbiología “cultivo-dependiente” en este aspecto dada su elevada especificidad, sensibilidad y velocidad para obtener resultados. En este proyecto se ha puesto a punto un ensayo qPCR para determinar la concentración de este microorganismo y evaluado la aplicación de esta técnica para la predicción de vida útil en merluza conservada en atmósfera modificada rica en CO2. Los resultados obtenidos indican que el ensayo de qPCR que se ha puesto a punto es un método rápido y efectivo para determinar la concentración de P. phosphoreum en filetes de merluza. Por otra parte, este ensayo, combinado con el modelo predictivo desarrollado por Artaiz (2016) estimó una vida útil de la merluza muy similar a la determinada mediante análisis sensorial, lo que indica que de este modo se puede predecir la vida útil del pescado en pocas horas. Finalmente, se ha logrado poner a punto un protocolo de extracción de DNA bacteriano purificado para comenzar el estudio del metagenoma del pescado, que permita comparar la flora total del pescado fresco, frente a la que está presente en el pescado alterado

Prevalence of Toxoplasma gondii in retail fresh meat products from free-range chickens in Spain

Introduction: Toxoplasma gondii is one of the most prevalent zoonotic protozoan parasites worldwide and affects the vast majority of warm-blooded animal species, including humans. Postnatal infection in humans occurs through the ingestion of sporulated T. gondii oocysts or via the oral intake of parasite tissue cysts during the consumption of raw or undercooked meat. In this regard, given their high exposure to oocysts, chickens (Gallus domesticus) raised on the ground constitute a potential source of T. gondii. Material and Methods: For the first time in Spain, a survey was undertaken in commercial retail free-range poultry. A total of 50 thighs from different animals were analysed. The samples were homogenised and an acid pepsin digestion procedure was applied prior to molecular analysis. Toxoplasma gondii DNA was isolated from meat by qPCR. Two sets of primers were used for DNA amplification targeting the specific sequence of a 529 bp repeat element and another set of primers was utilised for the surface antigen protein-1 gene. Results: DNA extracted from 5 out of 50 tissue samples was positive for both genes by qPCR amplification. Conclusion: The 10% prevalence of Toxoplasma infection found in commercial free-range chickens raises public health issues

Campylobacter en pollos de engorde: contribución a su epidemiología, control y profilaxis mediante el uso de métodos de biología molecular, análisis antimicrobiano y evaluación de un tratamiento preventivo

En la actualidad, y desde los últimos doce años, la campilobacteriosis continúa siendo la zoonosis con el mayor número de casos humanos notificados en la Unión Europea (229.213 en el año 2015). Es por ello que la mayoría de los Estados Miembros tienen la obligación de notificarlos, siendo Campylobacter jejuni la especie termofílica aislada con mayor frecuencia en las personas, seguida en la distancia de Campylobacter coli. La principal fuente de infección humana es el consumo de carne de pollo contaminada por este patógeno.Esta Tesis tiene como objetivo principal diseñar e implementar técnicas de diagnóstico rápido fiables basadas en biología molecular con el fin de permitir su detección en explotaciones de pollos de engorde. Por otra parte, se ha realizado un estudio minucioso acerca de la resistencia antimicrobiana a partir de diferentes aislados procedentes de muestras de calzas. La metodología empleada consistió en la técnica de microdiluciones y la detección de genes de resistencia para los antibióticos que se administran con mayor frecuencia en avicultura de carne.Otro de los enfoques de este Trabajo radica en el estudio de la microbiota intestinal de ciegos de pollos para observar el efecto de un pienso complementario líquido administrado en el agua de bebida (Vitaid) mediante secuenciación masiva.Los resultados derivados de la puesta a punto de las diferentes técnicas diagnósticas revelaron excelentes valores de validez y fiabilidad (> 99%) en todas las pruebas diseñadas para la detección individual o conjunta de Campylobacter (C. jejuni o C. coli). Además, se aislaron 23 cepas de Campylobacter sobre un total de las 25 naves positivas, con tan solo un aislado correspondiente a C. coli. El estudio antimicrobiano determinó una correlación del 100% entre el resistotipo (amoxicilina, doxiciclina, enrofloxacina, lincomicina y tilosina) y el genotipo resistente presente en todos los aislados bacterianos. Asimismo, se ha detectado la mutación Thr86Ile en la región QRDR del gen gyrA para todos los aislados de C. jejuni.Para finalizar, el análisis de secuenciación masiva reflejó una mayor diversidad de especies microbianas en los individuos tratados en relación al grupo control. Además, se observó que las hembras poseían una microbiota más heterogénea en comparación a los machos. Sin embargo, este ensayo preventivo no resultó efectivo para Campylobacter ya que aumentó entre 2-4 veces su carga bacteriana.<br /

Situación Epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica

La leishmaniosis canina (LC) en una zoonosis que ha sido estudiada con gran énfasis por veterinarios durante los últimos años, cuyo principal reservorio es el perro, y que se estima afecta actualmente a dos millones y medio de perros en el suroeste de Europa. Hasta la actualidad se ha estado estimando la prevalencia de esta enfermedad mediante estudios serológicos, los cuales han subestimado la prevalencia de la infección. Con el reciente desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular, se esta descubriendo que una gran proporción de animales asintomáticos y serológicamente negativos son portadores de este parásito en sangre, por lo que pueden transmitir la infección. En este estudio realizado sobre 98 perros asintomáticos de un área endémica de LC, se ha estimado la prevalencia actual de infectados mediante IFI y qPCR en sangre, diagnosticando a los animales entre 3 y 5 meses después de la época de exposición al vector. Se han obtenido resultados que indican que la prevalencia por qPCR (58,16%) es sustancialmente mayor a la estimada por IFI (8,16%) lo cual nos da a entender que hay muchos mas animales infectados de lo que se pensaba y que estos responden positivamente frente a la infecció

La besnoitiosis bovina: comparación del diagnóstico serológico (IFI) frente a la RP-PCR en hisopos conjuntivales

La besnoitiosis bovina es una enfermedad de etiología parasitaria con cierta importancia económica en el sector bovino, caracterizada por un deterioro progresivo de los animales. Uno de los problemas principales a la hora de controlar la besnoitiosis en una explotación es su diagnóstico, pues las fases iniciales de la infección cursan con signos clínicos inespecíficos y cuando la respuesta inmune específica del animal se activa, el parásito se enquista en sus órganos diana y es más difícil de detectar. Las pruebas de elección para detectar la enfermedad hoy en día son serológicas (como IFI o ELISA), pero estas pruebas requieren tomar muestras de sangre y realizar un manejo de los animales más invasivo. Teniendo en cuenta que la conjuntiva ocular es uno de los órganos diana de Besnoitia besnoiti y que los parásitos se encuentran en ella formando quistes fácilmente accesibles, en este trabajo se propone intentar sustituir una de las pruebas de elección actuales (la IFI) por otra cuya toma de muestras resulta menos lesiva, como la RT-PCR de hisopado de conjuntiva ocular. En el estudio se concluye que el hisopado de conjuntiva no parece ser capaz de detectar animales positivos con tanta sensibilidad diagnóstica como la IFI, y se sugieren cambios que podrían realizarse en el desarrollo de la prueba para mejorar los resultados en futuras investigaciones

Widespread distribution of hepatitis E virus in Spanish pig herds

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Hepatitis E virus (HEV) infection is a serious health problem in developing countries and is also increasingly reported in industrialized regions. HEV is considered a zoonotic agent and strains isolated from swine and human sources are genetically similar. Thus, HEV is of increasing importance to both public and animal health. The aim of the present study was to evaluate the distribution of HEV in a large population of pigs from herds located in different autonomous regions throughout Spain.</p> <p>Results</p> <p>The presence of anti-HEV IgG antibodies was analyzed in 1141 swine serum samples (corresponding to 381 pigs younger than 6 months and 760 pigs older than 6 months) collected from 85 herds. Herds were located in 6 provinces in 4 autonomous regions throughout Spain. At least one pig tested positive for anti-HEV IgG in over 80% of herds. Of individual pigs, 20.4% (233/1141) were positive for anti-HEV IgG, with the prevalence being higher in adult pigs than in those under 6 months (30.2% <it>vs. </it>15.5%). A subset of serum samples taken at 2- to 5-week intervals showed that seroprevalence dropped between 3 and 11 weeks of age, and then rose significantly by the 15th week. Pigs were also examined for the presence of HEV-RNA by RT-PCR. Of pigs tested for the presence of HEV-RNA 18.8% (64/341) were positive, with at least one pig in almost half of the herds testing positive. HEV-RNA amplicons from several positive pigs were sequenced and all were of genotype 3.</p> <p>Conclusions</p> <p>HEV was found to be widely distributed among swine farms across Spain, with the prevalence being highest among animals older than 6 months. These results indicate that HEV infection either is or is likely to become endemic in the Spanish swine population.</p

Estimation of the relative sensitivity of qPCR analysis using pooled samples.

The high sensitivity of qPCR makes it a desirable diagnostic method in epidemiological surveillance programs. However, due to high costs, the use of pooling has been suggested. In this paper, an algorithm based on the Montecarlo method has been designed and implemented. The algorithm had been tested in many different situations, and finally it was validated with a real dataset. Moreover, based on the results obtained and depending on pooling conditions, a drastic decrease of sensitivity is observed

Direct Inhibitory Effect of Rotavirus NSP4(114-135) Peptide on the Na(+)-d-Glucose Symporter of Rabbit Intestinal Brush Border Membrane

The direct effect of a rotavirus nonstructural glycoprotein, NSP4, and certain related peptides on the sodium-coupled transport of d-glucose and of l-leucine was studied by using intestinal brush border membrane vesicles isolated from young rabbits. Kinetic analyses revealed that the NSP4(114-135) peptide, which causes diarrhea in young rodents, is a specific, fully noncompetitive inhibitor of the Na(+)-d-glucose symporter (SGLT1). This interaction involves three peptide-binding sites per carrier unit. In contrast, the Norwalk virus NV(464-483) and mNSP4(131K) peptides, neither of which causes diarrhea, both behave inertly. The NSP4(114-135) and NV(464-483) peptides inhibited Na(+)-l-leucine symport about equally and partially via a different transport mechanism, in that Na(+) behaves as a nonobligatory activator. The selective and strong inhibition caused by the NSP4(114-135) peptide on SGLT1 in vitro suggests that during rotavirus infection in vivo, NSP4 can be one effector directly causing SGLT1 inhibition. This effect, implying a concomitant inhibition of water reabsorption, is postulated to play a mechanistic role in the pathogenesis of rotavirus diarrhea

Evaluación de tres PCR cuantitativas para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos en Nicaragua

Introduction: Molecular biology diagnostic methods such as real-time PCR should be used in Nicaragua to improve the diagnosis of leptospirosis in humans and animals.Objective: To evaluate three qPCR methods for pathogenic Leptospira detection in domestic animals.Materials and methods: Real-time PCR primers were designed for the amplification of specific regions from the Lip 32 gene of Leptospira in SYBER Green (SYBER Green-A) and TaqMan, as well in SYBER Green-B as previously published. The sequences of 12 strains obtained from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) were aligned to select probes and primers. The analytical sensitivity was determined by calculating the detectable genomic equivalent while 18 pathogenic references strains and 28 negative controls were used to evaluate the sensitivity and specificity of each one of the three sets in 129 urine samples of domestic animals.Results: The detection limit of four genomic equivalents per reaction was obtained from SYBR Green-A. The specificities were 94.4% (95% CI: 81.1-100.0) for TaqMan, 77.8% (95% CI: 55.8-99.8) for SYBR Green-A, while for SYBR Green-B it was 61.1% (95% CI: 35.8-86.4). In the three tests, we obtained a specificity of 100% (95% CI: 98.2-100.0). In the field samples, 26.4% were positive with SYBR Green-A and 6.1% with SYBR Green-B.Conclusion: SYBR Green-A presented the lowest detection limit while the three techniques under evaluation showed high specificity while TaqMan was the most sensitive.Introducción. En Nicaragua es necesario estandarizar pruebas moleculares como la PCR en tiempo real (quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) que mejoren el diagnóstico de leptospirosis en humanos y animales.Objetivo. Evaluar tres qPCR para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos de Nicaragua.Materiales y métodos. Se diseñaron cebadores para la amplificación del gen LipL32 en SYBR Green (SYBR Green-A) y TaqMan, y en otros descritos previamente (SYBR Green-B). Las secuencias de 12 cepas obtenidas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se alinearon para la búsqueda de sondas y cebadores. La sensibilidad analítica se determinó calculando el equivalente genómico detectable, se utilizaron 18 cepas de referencia para la sensibilidad diagnóstica y 28 controles negativos para la especificidad. Los métodos se aplicaron en 129 muestras de orina de animales domésticos.Resultados. En SYBR Green-A se obtuvo un límite de detección de cuatro equivalentes genómicos; en TaqMan, la sensibilidad fue del 94,4 % (IC95% 81,1-100,0). Con SYBR Green-A, se obtuvo una sensibilidad del 77,8 % (IC95% 55,8-99,8), en tanto que con SYBR Green-B fue del 61,1 % (IC95% 35,8-86,4). En las tres pruebas se logró una especificidad del 100 % (IC95% 98,2-100,0). El 26,4 % de las muestras de animales domésticos fueron positivas con SYBR Green-A y el 6,2 % con SYBR Green-B.Conclusiones. El SYBR Green-A presentó un límite de detección bajo, en tanto que las tres técnicas evaluadas mostraron alta especificidad, en tanto que la TaqMan tuvo la mayor sensibilidad