Delineating the antigenotoxic and anticytotoxic potentials of 4-methylimidazole against ethyl methanesulfonate toxicity in bone marrow cell of swiss albino mice

4-Methylimidazole (4-MEI) is mostly used in beverages and coloring food, dark beers and common brands of cola drinks, which may contain more than 100 μg of this compound per 12-ounce serving. This study was aimed to investigate the antigenotoxic and anticytotoxic effects of 4-MEI (100, 130 and 160 mg/kg) against ethyl methanesulfonate (240 mg/kg) using chromosome aberrations (CAs) and Mitotic index (MI) tests in bone marrow cells of Swiss Albino Mice at 12 h and 24 h treatment periods. So, the t-test was used for the statistical analysis. In this research, 4-MEI at all concentrations for 12 h treatment period reduced chromosomal aberrations and at 130 and 160 mg/kg concentrations for 24 h treatment period increased chromosomal aberrations induced by EMS (240 mg/kg), but th ese reductions and increases were not significant. Also, intraperitoneal injection of 4-MEI at doses of 100, 130 and 160 mg/kg combined with EMS (240 mg/kg) showed that the mitotic index was decreased at 100 and 130 mg/kg for 12h and 130 mg/kg for 24 h treatment periods, when compared to positive sample (EMS), but did not show any statistically difference from the EMS treated group. It can be concluded that 4-MEI might not be antigenotoxic and protective effects in bone marrow cells of Swiss Albino Mice, because 4-MEI could not reduce the chromosomal aberrations induced by EMS

Bacillus subtilis’ten lakkaz enzim izolasyonu, üretici genin klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve boya gideriminde etkinliğinin araştırılması

Bakteriyel lakkaz yüksek sıcaklık ve pH’larda stabildir. Lakakz’ın birçok biyoteknolojik ve endüstriyel uygulamaları vardır. Bu çalışmanın amacı lakkaz pozitif yerel bir izolat olan Bacillus subtilis OH 67’nin lakkaz enzimini klonlamak, eksprese etmek, saflaştırmak, boya giderici kapasitesi araştırmak ve karakterize etmektir. Lakkaz pozitif suş (Bacillus subtilis OH 67) İstanbul-Türkiye'den izole edilmiştir. Bakteri DNA’sı PCR ve klonlama için kullanılmıştır. PCR ürünü (855bp), uygun ekspresyon vektörüne (pET22 b) aktarıldıktan sonra konak hücresinde (E. coli BL21 (DE3)) transforme edilmiştir. DNA kodlayan lakkaz gen dizisi birçok bakteri türü ile karşılaştırılmış ve Bacillus subtilis ile %99 ve diğer bakteri türleri ile %87- %99 arasında benzerlik göstermiştir. Rekombinant lakkaz aktivitesi Guaiachol oksidasyonu ile araştırılmıştır. SDSPAGE uygulaması sonucu enzimin moleküler ağırlığı 34 kDa olmuştur. Optimum pH ve sıcaklık sırayla 6,6 ve 50°C olmuştur. Rekombinant lakkaz 40 °C ve 60 °C'de %91 ve %90 aktivite göstermiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri 110,7721 ?M ve 19,3 ?mol/min/mg olmuştur. Lakkazın boya giderim potansiyeli 16 farklı boya üzerinde incelenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları saflaştırılmış lakkazın CuSO4’ün varlığında endüstriyel ve kimyasal boyaların gideriminde güçlü bir şekilde etkili olduğunu göstermiştir. Lakkaz aktivitesi FeSO4 (5mM) 'ın ilavesiyle artmıştır. Rekombinant lakkaz 1mM’lık EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2 ve ZnCl2 tarafından orta derecede inhibe edilmiştir. Ayrıca 5 mM konsantrasyondaki SDS, HgCl2, üre, 2-merkaptoetanol, Tween-80 lakkaz aktivitesini %50’nin altına düşürmüştür. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre E. coli'de rekombinant lakkaz enzimin üretimi endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir aday olduğunu ortaya koymuştur. Enzim yüksek sıcaklıklarda aktivitesini korumuştur. Sonuç olarak, enzim modifikasyona değer ve gelecekte endüstrinin farklı alanlarında kullanılabilir.Bacterial laccases are very stable at high temperature and pH values. Laccase has many biotechnological and industrial applications. This research was aimed to clone, express, purify, characterize, and decolorization activity of the laccase from a local isolate Bacillus subtilis OH 67. The laccase positive strain (Bacillus subtilis OH 67) was isolated from Istanbul- Turkey. PCR product (Laccase gene) was transformed to E. coli BL21 (DE3) after ligation to pET22b vector. DNA sequence of laccase gene has a 99% similarity with Bacillus subtilis, but the other strains identity was among 87%-99%. The molecular weight of recombinant laccase was assigned as 34 kDa. Optimum pH and temperature of recombinant laccase was 6,6 and 50oC. Recombinant laccase exhibited 91% and 90% activity at 40°C and 60°C. The Km and Vmax values of the enzyme were obtained as 110,7721 ?M and 19,3 ?mol/min/mg. The recombinant laccase strongly decolorized 16 types of industrial and chemical dyes. Laccase activity was increased by addition of FeSo4 (5mM). Recombinant laccase was moderately inhibited by EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2, and ZnCl2. Moreover, the recombinant laccase activity was found to be less than 50% in the presence of SDS, HgCl2, Urea, 2-Mercaptoethanol, Tween-80 at a concentration of 5mM. In conclusion, the production of recombinant laccase enzyme in E. coli proved to be a promising candidate for industrial and biotechnological applications. The enzyme maintained its activity at high temperatures. As a result, the enzyme is worthy of modification and can be used in different area of industry in the future.Bu tez çalışması pamukkale üniversitesi bilimsel araştırma projeleri tarafından 2016FEBE043 nolu proje ile desteklenmiştir

Cloning and expression of phytase from Bacillus sp.

TEZ10771Tez (Yüksek Lisans) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2015.Kaynakça (s. 55-63) var.xii, 64 s. : res. (bzs. rnk.), tablo ; 29 cm.Fitaz enzimi fitatın fosfomonoester bağını hidrolize ederek myo-inositol fosfat ve inorganik fosfatın ortaya çıkmasına sebep olur. Hayvanların büyümeleri, üremeleri ve kemiklerinin şekillenmesi için önemli minerallerden biri fosfordur. Yapılan bu araştırmada fitaz aktivitesine sahip olan doğal Bacillus sp. biyokimyasal ve 16srDNA sekans analizi ile Bacillus subtilis olarak tanımlanmıştır. Primerler NCBI sitesinde olan Bacillus subtilis bakterisinin fitazına göre dizayn edilmiştir. PCR amplifikasyonundan sonra fitaz geni ekspresyon vektörü olan pET22b vektörüne ligasyonu yapılmıştır ve Rekombinanat vektör ısı şoku metodu ile E. coli Rosetta 2(DE3) pLysS bakterisine aktarılmıştır. Kullanılan PCR ürünü ve vektör ligasyonu yapılmadan önce Hind III ve BamH1 enzimleri ile kesimleri gerçekleştirilmiştir. Rekombinant fitaz 37oC, pH 7’de optimum aktivite göstermiştir. Enzimin 60oC’de aktivitesinin %73’nü ve 100 oC’de ise aktivitesinin %5’ni korumuştur. Enzim pH 5.8-8 aralığında stabildir. Rekombinant enzimin aktivitesi 5mM CoCl2 ile artmıştır ama MgCl2, CuCl2, HgCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl2 ve EDTA ile aktivitesi düşmüştür. Rekombinant fitazın moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizi ile 45 kDa olarak belirlenmiştir. Bu araştırmanın sonuçlarına göre elde edilen rekombinant fitazın yem katkısı olarak kullanılabilirliği ortaya konulmuştur.Phytases catalyze the hydrolysis of phosphomonoester bonds of phytate (myo-inositol hexakisphosphate), thereby creating lower forms of myo-inositol phosphates and inorganic phosphate. Phosphorus is one of the necessary mineral nutrients for animals during their growth, reproduction and calcification of the bones. In this research, one native Bacillus sp. isolate containing phytase activity was identified as a Bacillus subtilis by biochemical and 16srDNA sequence analysis. Primer pairs were designed according to phytase gene sequence of Bacillus subtilis present in NCBI web site. After amplification by PCR the gene was ligated to pET22b vector as expression vector and transformed to E. coli Rosetta 2(DE3) pLysS by heat shock method. In preparation of PCR product and vector for ligation two restriction enzymes (Hind III and BamH1) were used. The optimum activity of recombinant phytase was emerged at 37oC and pH 7. Thermo stability with more than 73% residual activity at 60oC, and about 5% residual activity at 100?C. The enzyme was stable over the pH range of 5.8 to 8. Recombinant phytase activity significantly stimulated with 5mM CoCl2, but decreased activity with MgCl2, CuCl2, HgCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl2 and EDTA. Molecular weight of recombinant phytase was estimated as 45 kDa on SDS-PAGE analysis. These results of this study showed that, recombinant phytase could be an interesting candidate for feed applications.Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: FBE2013YL3

Delineating the antigenotoxic and anticytotoxic potentials of 4-methylimidazole against ethyl methanesulfonate toxicity in bone marrow cell of swiss albino mice

4-Methylimidazole (4-MEI) is mostly used in beverages and coloring food, dark beers and common brands of cola drinks, which may contain more than 100 µg of this compound per 12-ounce serving. This study was aimed to investigate the antigenotoxic and anticytotoxic effects of 4-MEI (100, 130 and 160 mg/kg) against ethyl methanesulfonate (240 mg/kg) using chromosome aberrations (CAs) and Mitotic index (MI) tests in bone marrow cells of Swiss Albino Mice at 12 h and 24 h treatment periods. So, the t-test was used for the statistical analysis. In this research, 4-MEI at all concentrations for 12 h treatment period reduced chromosomal aberrations and at 130 and 160 mg/kg concentrations for 24 h treatment period increased chromosomal aberrations induced by EMS (240 mg/kg), but th ese reductions and increases were not significant. Also, intraperitoneal injection of 4-MEI at doses of 100, 130 and 160 mg/kg combined with EMS (240 mg/kg) showed that the mitotic index was decreased at 100 and 130 mg/kg for 12h and 130 mg/kg for 24 h treatment periods, when compared to positive sample (EMS), but did not show any statistically difference from the EMS treated group. It can be concluded that 4-MEI might not be antigenotoxic and protective effects in bone marrow cells of Swiss Albino Mice, because 4-MEI could not reduce the chromosomal aberrations induced by EMS