Immunhistochemische, zellbiologische und physiologische in vivo Untersuchungen zum Apelin/APJ-Systemin Hypothalamus und Hypophyse der Ratte

Der Hypothalamus repräsentiert die wichtigste Komponente des Zentralnervensystems (ZNS) zur Integration afferenter Signalinformationen und zur Regulation der Homöostase von Körperkerntemperatur, Wasser- und Elektrolythaushalt des Extrazellularraumes, circadianer Rhythmik sowie Energiehaushalt. Das wichtigste Kerngebiet (Nucleus) des Hypothalamus zur Steuerung der genannten physiologischen Funktionen stellt der in der supraoptischen Region, in unmittelbarer Nähe zum dritten Hirnventrikel gelegene Nucleus paraventricularis (PVN) dar. Der PVN enthält zahlreiche neurosekretorische Zellen und weist darüber hinaus zahlreiche efferente und afferente neuronale Verknüpfungen zu anderen Struktureinheiten des Gehirns auf. Zusätzlich zum PVN kommt auch dem im Bereich der Commissura anterior gelegenen Nucleus praeopticus medianus (MnPO) eine bedeutende, integrative Funktion bei der Regulation des Wasser- und Elektrolythaushaltes sowie der Körperkerntemperatur zu. Bei der Regulation dieser Prozesse spielt neben klassischen und peptidergen Neurotransmittern auch das gasförmige Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO), produziert unter anderem von der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS), eine wesentliche neuromodulatorische Rolle. Auch für das apelinerge System, bestehend aus den verschiedenen, aktiven Fragmenten des Preproapelins (Apelin36, Apelin17 und Apelin13) und dem G-Protein gekoppelten Rezeptor APJ, wurde bereits ein zentral vermittelter Einfluss unter anderem auf die Temperaturregulation und auf die Kontrolle des Wasser- und Elektrolythaushaltes beschrieben. Eine Expression sowohl der Apelinpeptide als auch des Rezeptors konnte bisher in peripheren Organen sowie im ZNS, und dabei hauptsächlich im Hypothalamus, gezeigt werden. Trotz zahlreicher Expressionsstudien fehlte jedoch bisher eine detaillierte Kartierung der Verteilung des Rezeptorproteins in Hypothalamus und Thalamus. (1) Anhand der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten immunhistochemischen Markierungen an coronalen Gehirnschnitten der Ratte wurde deshalb erstmalig eine detaillierte, semiquantitative Kartierung der Expression des APJ Proteins im Hypothalamus erstellt. Diese Untersuchung bestätigt einerseits die bereits auf mRNA-Ebene publizierte APJ-Expression in Strukturen wie PVN und Nucleus supraopticus (SON), konnte jedoch darüber hinaus in vielen Nuclei und/oder deren Substrukturen wie u.a. dem MnPO, dem medialen Teil des „Bed Nucleus“ der Stria terminalis, dem N. praecommissuralis und dem N. dorsomedialis eine APJ-Expression zum ersten Mal auf Proteinebene für einzelne Neurone bzw. deren Pseudopodia nachweisen. (2) Sowohl für den PVN als auch den MnPO wurde bereits eine Expression von nNOS in früheren Studien beschrieben. Zusätzlich dazu konnte in der Fachliteratur eine Vermittlung apelinerger Effekte über NO etwa anhand der Modulation kardiovaskulärer Parameter in der Peripherie postuliert werden. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit eine mögliche Co-Distribution und -Lokalisation von APJ und nNOS anhand immunhistochemischer Markierungen im Hypothalamus der Ratte untersucht. Dabei konnte u.a. im MnPO eine ausgeprägte Co-Distribution nitrerger Neurone und APJ-immunpositiver Faserstrukturen festgestellt werden. Bei der quantitativen Analyse der Expression von nNOS und APJ in Perikaryen des PVN und des SON hingegen war sogar mit mit ca. 40 % bzw. ca. 50 % markante zelluläre Co-Expression der beiden Moleküle nachweisbar. Aufgrund der ausgeprägten Co-Lokalisation und Co-Distribution in PVN und MnPO könnte somit NO als nachgeschaltetes Signalmolekül auch an der Vermittlung zentraler, apelinerger Wirkmechanismen beteiligt sein. (3) Zur in vitro Untersuchung Apelin-induzierter, intrazellulärer Signaltransduktions-mechanismen wurden aufgrund der ausgeprägten APJ-Rezeptorexpression sowohl MnPO- und PVN-spezifische neurogliale Primärkulturen als auch eine primäre Hypophysenzwischen-lappenkultur (HZL) herangezogen. Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) als wichtigen second oder third messenger konnten für einzelne Zellen durch den Einsatz calciumbindener Fluorophore wie Fura-2 kontinuierlich erfasst werden (=Calcium-Imaging). Sowohl für Neurone als auch Astrozyten der MnPO- und PVN-spezifischen Kulturen ergab sich bei 2-9 % der Zellen, in PVN-spezifischen Mikrogliazellen hingegen bei 12 % eine direkte Responsivität in Form einer transienten Erhöhung der [Ca2+]i nach Stimulation mit der pyroglutamylierten Form von Apelin13 (PyrAp13) (10-6 mol/l). Wie bereits für andere Neuropeptide beschrieben, vermochte PyrAp13 darüber hinaus den Calciumeinstrom des klassischen Neurotransmitters Glutamat in nitrergen und vor allem nicht-nitrergen Zellen sowohl positiv als auch negativ zu modulieren. Diese modulatorische Wirkung könnte somit möglicherweise die zelluläre Grundlage für physiologische Funktionen des apelinergen Systems als neuer Neuromodulator im ZNS darstellen. Neben der Analyse der [Ca2+]i als dem Apelin13 nachgeschalteten Signal wurde in einigen Publikationen auch über die Involvierung der MAP-Kinasen extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) im apelinergen Signalweg in peripheren oder transfizierten Zellsystemen berichtet. In der Primärkultur des HZLs mit hoher nativer APJ-Expression konnte in der vorliegenden Arbeit nach apelinerger Stimulation anhand von Western Blot Analysen jedoch keine Aktivierung der ERK1/2 beobachtet werden, möglicherweise bedingt durch eine bereits hohe Phosphorylierung vor der peptidergen Stimulation. (4) Als weiterer wichtiger Aspekt der wissenschaftlichen Arbeit wurden in vivo physiologische Parameter nach intracerebroventrikulärer (i.c.v.) Applikation von PyrAp13 (20 nmol) in der Ratte anhand telemetrischer Datenaufzeichnung untersucht. (A) I.c.v. mikroappliziertes PyrAp13 zeigte dabei keinen signifikanten Einfluss auf durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS, 100 μg/kg Körpergewicht) induzierte Komponenten des sickness behavior wie Anorexie, Adipsie und Lethargie. Jedoch führte es zu einer signifikanten Reduktion des LPS-induzierten Fiebers 3-6 und 6-9 Std. post injectionem und einem signifikanten erniedrigten Plasmaspiegel an Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) als prominenten proinflammatorischen Cytokin 2 Std. nach der Injektion. (B) Trotz der hohen Sequenzähnlichkeit von APJ und dem Angiotensin II (AngII)-Rezeptor und einer in vitro bereits gezeigten Interaktion mit diesem, zeigte i.c.v. mikroappliziertes PyrAp13 jedoch in vivo keinen Einfluss auf durch die zentrale AngII-Applikation induzierte Trinkwasseraufnahme bzw. nukleäre Translokation des neuronalen Aktivitätsmarkers und Transkriptionsfaktors c-Fos. (C) Weiterhin zeigte PyrAp13 i.c.v. selbst beim Vergleich der Injektion vor der Aktivitätsphase mit der Inaktivitätsphase der Versuchstiere keinen Einfluss auf die circadiane Rhythmik telemetrisch erfasster Parameter wie Körpertemperatur, lokomotorische Aktivität und Futter- bzw. Wasseraufnahme

Cysteinyl-leukotrienes contribute to sputum eosinophil chemotactic activity in asthmatics

Background: Cysteinyl-leukotrienes are lipid derived mediators involved in asthma. They are able to stimulate eosinophil chemotaxis in vitro. Induced sputum from asthmatics has been shown to contain eosinophil chemotactic activity. The purpose of our study was to evaluate the contribution of cysteinyl-leukotrienes to sputum eosinophil chemotactic activity in asthmatics and to seek whether there might be differences between asthmatics free of inhaled corticosteroids vs those regularly receiving this treatment. Methods: Twenty-two patients (11 corticosteroid free, mean FEV1 99% predicted, 11 corticosteroid-treated, mean FEV1 77% predicted) recruited from our asthma clinic underwent a sputum induction. Sputum was processed according to standard procedure. Eosinophil chemotactic activity contained in the fluid phase was assessed using Boyden microchamber model and expressed as chemotaxis index (CI). Cysteinyl-leukotrienes were measured in sputum supernatant by ELISA and their role in sputum eosionophil chemotactic activity was evaluated by using montelukast, a selective antagonist of a cys-LT1 receptor. Results: Cysteinyl-leukotrienes were well detectable in sputum supernatants from both steroid-naive (247 +/- 42 pg/ml) and steroid-treated (228 +/- 26 pg/ml) asthmatics. Sputum eosinophil chemotactic activity was indiscriminately present in both corticosteroid-naive (CI: 2.61 +/- 0.22) and corticosteroid-treated (2.98 +/- 0.35) asthmatics. Montelukast (100 mu M) significantly inhibited the eosinophil chemotactic activity in both groups achieving a mean inhibition of 54.2 +/- 9.2% (P < 0.001) and 64.7 +/- 7.8% (P < 0.001) in steroid-naive and steroid-treated asthmatics respectively. Conclusion: Cysteinyl-leukotrienes actively participate in sputum eosinophil chemotactic activity found in asthmatics irrespective of whether they are or not under treatment with inhaled corticoids.Peer reviewe

N-[Morpholino(phen­yl)meth­yl]benzamide

The title compound, C18H20N2O2, crystallizes with two mol­ecules in the asymmetric unit. The morpholine rings of both mol­ecules adopt chair conformations. The crystal structure is stabilized by inter­molecular N—H⋯O hydrogen bonds. One phenyl ring is disordered over two orientations in a 0.665 (5):0.335 (5) ratio

Roflumilast N-oxide, a PDE4 inhibitor, improves cilia motility and ciliated human bronchial epithelial cells compromised by cigarette smoke in vitro

BACKGROUND AND PURPOSEMucociliary malfunction occurs in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and compromised functions of ciliated bronchial epithelial cells may contribute to this. Cigarette smoke, a major risk factor for COPD, impairs ciliary beat frequency (CBF). cAMP augments CBF. This in vitro study addressed, in differentiated, primary human bronchial epithelial cells, whether roflumilast N-oxide, a PDE4 inhibitor, (i) augments CBF; (ii) prevents the reduction in CBF induced by cigarette smoke extract (CSE); and (iii) protects against the loss of the ciliated phenotype following long-term CSE exposure.EXPERIMENTAL APPROACHAir-liquid interface cultured human bronchial epithelial cells were incubated with roflumilast N-oxide and exposed to CSE. CBF was assessed by digital high speed video microscopy (DHSV). Ciliated cells were characterized by β-tubulin IV staining and analyses of Foxj1 and Dnai2 mRNA and protein (real-time quantitative PCR, Western blotting).KEY RESULTSRoflumilast N-oxide concentration-dependently triggered a rapid and persistent increase in CBF and reversed the decrease in CBF following CSE. Long-term incubation of bronchial epithelial cells with CSE resulted in a loss in ciliated cells associated with reduced expression of the ciliated cell markers Foxj1 and Dnai2. The PDE4 inhibitor prevented this loss in the ciliated cell phenotype and the compromised Foxj1 and Dnai2 expression. The enhanced release of IL-13 following CSE, a cytokine that diminishes the proportion of ciliated cells and in parallel, reduces Foxj1 and Dnai2, was reversed by roflumilast N-oxide.CONCLUSION AND IMPLICATIONSRoflumilast N-oxide protected differentiated human bronchial epithelial cells from reduced CBF and loss of ciliated cells following CSE

The selective phosphodiesterase 4 inhibitor roflumilast and phosphodiesterase 3/4 inhibitor pumafentrine reduce clinical score and TNF expression in experimental colitis in mice.

The specific inhibition of phosphodiesterase (PDE)4 and dual inhibition of PDE3 and PDE4 has been shown to decrease inflammation by suppression of pro-inflammatory cytokine synthesis. We examined the effect of roflumilast, a selective PDE4 inhibitor marketed for severe COPD, and the investigational compound pumafentrine, a dual PDE3/PDE4 inhibitor, in the preventive dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis model. The clinical score, colon length, histologic score and colon cytokine production from mice with DSS-induced colitis (3.5% DSS in drinking water for 11 days) receiving either roflumilast (1 or 5 mg/kg body weight/d p.o.) or pumafentrine (1.5 or 5 mg/kg/d p.o.) were determined and compared to vehicle treated control mice. In the pumafentrine-treated animals, splenocytes were analyzed for interferon-γ (IFNγ) production and CD69 expression. Roflumilast treatment resulted in dose-dependent improvements of clinical score (weight loss, stool consistency and bleeding), colon length, and local tumor necrosis factor-α (TNFα) production in the colonic tissue. These findings, however, were not associated with an improvement of the histologic score. Administration of pumafentrine at 5 mg/kg/d alleviated the clinical score, the colon length shortening, and local TNFα production. In vitro stimulated splenocytes after in vivo treatment with pumafentrine showed a significantly lower state of activation and production of IFNγ compared to no treatment in vivo. These series of experiments document the ameliorating effect of roflumilast and pumafentrine on the clinical score and TNF expression of experimental colitis in mice

In Vitro and in Vivo Anti-Inflammatory Activity of the New Glucocorticoid Ciclesonide

ABSTRACT The glucocorticoid ciclesonide is the 2ЈR-epimer of 2Ј-cyclohexyl-11␤-hydroxy-21-isobutyryloxy-16bH-dioxolo [5Ј,4Ј:16,17]pregna-1,4-diene-3,20-dione. The active metabolite desisobutyrylciclesonide (des-CIC) is derived from ciclesonide by esterase cleavage of isobutyrate at the C21 position. The relative binding affinities at the rat glucocorticoid receptor were dexamethasone, 100; ciclesonide, 12; des-CIC, 1212; and budesonide, 905. Des-CIC potently inhibited the activation of murine and human lymphocytes in a series of different in vitro systems. With the exception of concanavalin A-stimulated rat spleen cells, des-CIC was more potent than the parent compound. Des-CIC compared well with budesonide in all in vitro systems. Furthermore, the respective 2ЈS-epimers were always significantly less potent than the 2ЈR-epimers. In vivo, ciclesonide (intratracheal administration), des-CIC, and budesonide inhibited antigen-induced accumulation of eosinophils, protein, and tumor necrosis factor-␣ into the bronchoalveolar lavage fluid of ovalbumin-sensitized and -challenged Brown Norway rats with an ED 50 value ranging from 0.4 to 1.3 mg/kg, indicating similar potency, which suggests in vivo activation of the parent compound. Ciclesonide and budesonide inhibited the bradykinin-induced protein leakage into the rat trachea. In the rat cotton pellet model, ciclesonide inhibited granuloma formation (ED 50 :ϭ of 2 g/pellet), whereas budesonide and des-CIC were 15-and 20-fold less active; thymus involution was induced with an ED 50 of 303, 279, and 154 g/pellet, respectively. When applied orally to rats for 28 days, ciclesonide showed low potency in reducing weight of thymus and adrenals, suggesting low oral bioavailability. The in vivo data on ciclesonide highlight its effective local action and a reduced potential for side effects

Cyclic AMP Control Measured in Two Compartments in HEK293 Cells: Phosphodiesterase KM Is More Important than Phosphodiesterase Localization

The intracellular second messenger cyclic AMP (cAMP) is degraded by phosphodiesterases (PDE). The knowledge of individual families and subtypes of PDEs is considerable, but how the different PDEs collaborate in the cell to control a cAMP signal is still not fully understood. In order to investigate compartmentalized cAMP signaling, we have generated a membrane-targeted variant of the cAMP Bioluminiscence Resonance Energy Transfer (BRET) sensor CAMYEL and have compared intracellular cAMP measurements with it to measurements with the cytosolic BRET sensor CAMYEL in HEK293 cells. With these sensors we observed a slightly higher cAMP response to adenylyl cyclase activation at the plasma membrane compared to the cytosol, which is in accordance with earlier results from Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensors. We have analyzed PDE activity in fractionated lysates from HEK293 cells using selective PDE inhibitors and have identified PDE3 and PDE10A as the major membrane-bound PDEs and PDE4 as the major cytosolic PDE. Inhibition of membrane-bound or cytosolic PDEs can potentiate the cAMP response to adenylyl cyclase activation, but we see no significant difference between the potentiation of the cAMP response at the plasma membrane and in cytosol when membrane-bound and cytosolic PDEs are inhibited. When different levels of stimulation were tested, we found that PDEs 3 and 10 are mainly responsible for cAMP degradation at low intracellular cAMP concentrations, whereas PDE4 is more important for control of cAMP at higher concentrations