Реконструированный эпидермис человека in vitro — модель для фундаментальных и прикладных исследований кожи человека

Background. The reconstructed human epidermis (RE) is an in vitro tissue-engineering construct similar to the native epidermis. Objective. To develop a full-layer RE. Describe its structure: determine the presence of all layers of the epidermal component, including basal, spinous and granular layers and stratum corneum of the epidermis; detect the basement membrane, the border between the epidermal and mesenchymal component. Materials and methods. Isolation of keratinocytes and fibroblasts from human donor skin. Cultivation of keratinocytes and fibroblasts in vitro under 2D conditions, cell subculturing and 3D modeling of RE, obtaining cryosections, histological staining, immunohistochemical (IHC) study with antibodies to cytokeratins 14 and 10, Ki67 protein, loricrin, laminin 5 and plectin. Results. A technique was developed for the formation of RE. Histological examination showed that the stratification of keratinocyte layers occurs during the formation of RE. Layers are formed including basal, spinous and granular layers and stratum corneum. The IHC study has shown the proliferative activity of keratinocytes of the basal layer and has detected the presence of marker proteins of keratinocytes at different stages of differentiation. RE basal keratinocytes, like native ones, form hemidesmosomes and synthesize basement membrane proteins. Conclusions. A full-layer human RE was obtained in vitro. RE meets all the characteristics of the native epidermis and it is suitable for basic and practical research in the field of skin biology, dermatology, and cosmetology.Реконструированный эпидермис человека (РЭ) тканеинженерная конструкция in vitro, подобная нативному эпидермису. Цель исследования. Разработать полнослойный РЭ. Охарактеризовать его структуру: определить наличие всех слоев эпидермального компонента, в том числе базального, шиповатого, гранулярного и рогового слоев эпидермиса; детектировать базальную мембрану, границу между эпидермальным и мезенхимальным компонентом. Материалы и методы. Выделение кератиноцитов и фибробластов из донорской кожи человека. Культивирование кератиноцитов и фибробластов в 2D-условиях in vitro, пересев клеток и формирование 3D-модели РЭ, получение криосрезов, гистологическая окраска, иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с антителами к цитокератинам 14 и 10, белку Ki67, лорикрину, ламинину 5 и плектину. Результаты. Разработана методика формирования РЭ. Гистологическое исследование показало, что при формировании РЭ происходит стратификация слоев кератиноцитов. Формируются слои базальных, шиповатых, гранулярных и ороговевающих кератиноцитов. С помощью ИГХ-исследования показали пролиферативную активность кератиноцитов базального слоя и детектировали наличие белков-маркеров, характерных для кератиноцитов на разных стадиях дифференцировки. Базальные кератиноциты РЭ подобно нативным формируют гемидесмосомы и синтезируют белки базальной мембраны. Заключение. Получен отвечающий всем характеристикам нативного эпидермиса полнослойный РЭ человека in vitro, пригодный для фундаментальных и практических исследований в области биологии кожи, дерматологии и косметологии

Red fluorescent protein with reversibly photoswitchable absorbance for photochromic FRET

SummaryWe have developed the first red fluorescent protein, named rsTagRFP, which possesses reversibly photoswitchable absorbance spectra. Illumination with blue and yellow light switches rsTagRFP into a red fluorescent state (ON state) or nonfluorescent state (OFF state), respectively. The ON and OFF states exhibit absorbance maxima at 567 and 440 nm, respectively. Due to the photoswitchable absorbance, rsTagRFP can be used as an acceptor for a photochromic Förster resonance energy transfer (pcFRET). The photochromic acceptor facilitates determination of a protein-protein interaction by providing an internal control for FRET. Using pcFRET with EYFP as a donor, we observed an interaction between epidermal growth factor receptor and growth factor receptor-binding protein 2 in live cells by detecting the modulation of both the fluorescence intensity and lifetime of the EYFP donor upon the ON-OFF photoswitching of the rsTagRFP acceptor