Caratterizzazione biologica di matrici per il trattamento di erniazioni addominali: MES-STAR project

Le erniazioni della parete addominale, causate dalla fuoriuscita di un viscere dalla cavità che lo accoglie, sono la patologia più frequente in cui si imbatte un chirurgo; in Italia il numero di interventi supera i 100.000 l'anno, questo ovviamente comporta un elevato costo sociale. Le tecniche chirurgiche utilizzate per trattare le ernie si sono molto sviluppate e, negli ultimi anni, si è passati da Erniorrafie under-tension, che prevedono la sola ricostruzione della parete suturando i diversi piani anatomici, alle Ernioplastiche prostetiche, ricostruzioni tension-free eseguite con l'ausilio di protesi biocompatibili che sostituiscono e rinforzano i tessuti stessi. Nonostante il notevole decremento delle recidive, che sono passate dal 40% dei casi con le Erniorrafie al 20% con le tecniche prostetiche, il problema dello sviluppo di laparocele (erniazioni secondarie) rimane di primaria importanza. L'ampio impiego delle protesi nella chirurgia delle ernie addominali ha portato l'esigenza di uno studio accurato dei materiali impiegati e degli effetti collaterali. Il progetto MES-STAR si pone l'obiettivo di sviluppare protesi tecnologicamente innovative capaci di incrementare il tasso di rigenerazione tissutale e, al tempo stesso, di ridurre gli effetti secondari come lo sviluppo della reazione da corpo estraneo e la formazione di adesioni con i visceri. Il lavoro di tesi, svolto in collaborazione con l'azienda DIPROMED s.r.l (San Mauro Torinese, TO), mira alla caratterizzazione biologica di matrici per la realizzazione di nuove protesi erniarie. La sperimentazione ha previsto, inizialmente, la valutazione di biocompatibilità delle matrici prese in considerazione grazie a test di citotossicità, effettuati seguendo le direttive ISO 10993 standard. Questi test hanno permesso di fare uno screening dei campioni e di selezionare i materiali da sottoporre alle fasi successive di caratterizzazione biologica. Sui questi materiali è stato valutato sia il trend di crescita cellulare, con saggi di vitalità a tempistiche definite, sia la produzione di marker correlati al processo infiammatorio. Nello specifico, nel mezzo di coltura, è stata quantificata la presenza dell'interleuchina 6 (IL-6, marker pro-infiammatorio) e l'interleuchina 10 (IL-10 marker anti-infiammatorio). La caratterizzazione ha previsto inoltre l’analisi di distribuzione del collagene di tipo I e di tipo III (coinvolti nel processo di rigenerazione del tessuto) con tecniche di immunoistochimica nonché la produzione delle diverse componenti della matrice extracellulare e del relativo secretoma cellulare tramite spettrometria di massa. Sulle protesi risultate biocompatibili e con un buon trend di crescita cellulare, le analisi dei marker infiammatori nel mezzo di coltura hanno mostrato la tendenza all'incremento dell'IL-6 e, parallelamente, al decremento dell'IL-10. I saggi immunoistochimici effettuati al 21° giorno di coltura hanno evidenziato un aumento nella secrezione del collagene di tipo III (neoformato). Gli esperimenti sono stati eseguiti sotto la supervisione del Dott. Federico Vozzi nel laboratorio di Materiali Biomimetici ed Ingegneria dei Tessuti Biologici del Prof. Claudio Domenici sito presso l'Istituto di Fisiologia Clinica (IFC) del CNR di Pisa

Design and Validation of an Open-Hardware Print-Head for Bioprinting Application

In the last decades drop-on-demand inkjet technology played an increasing role in industrial and medical applications. This is due to the ability to deposit a small amount of material in precisely defined position. In the field of Biofabrication, inkjet printers are used to build 2D and 3D scaffolds and gels with biological molecules, including living cells. Several works, including seminal papers on inkjet bioprinting, were carried out with modified office printers. These printers have fixed structural characteristics and operating size, especially on the print-head, limiting the range of materials that can be dispensed. The aim of the present work is the design and fabrication of an open-source piezoelectric inkjet print-head, optimized for the bioprinting field. This low-cost, reproducible, reliable, versatile and biocompatible device will enable various research laboratories to work with a shared device; the open source allowing for parts to be modified to suit specific needs. The design was carried out by Finite Element (FE) modelling of the piezoelectric, mechanical, fluid dynamics and their coupling. The design was optimized for shear rate, which we minimized in order to be able to print cells. The mechanical frame of the printer was designed and built using a low-cost 3D printer. The nozzle plate was fabricated from a polycarbonate disc coated with biocompatible silicone, to increase the hydrophobicity of the outer surface of the disc, preventing ink adhesion on the edge of the nozzle; the refilling system, and the electronic control were also part of the project and will be freely available to download. The FE models were validated with ad-hoc experiments, printing water, gelatin solution, and cell culture media, by modulating the wave power in amplitude, frequency and duty cycle. The tests showed a large working window both respect to viscosity and to surface tension. Finally Human Skin Fibroblasts (ATCC-CRL- 2522, Teddington UK), suspended in culture media, were printed. Cell viability, assessed by CellTiter-Blue and LIVE / DEAD tests, resulted comparable with the control, demonstrating the validity of the first open source piezoelectric inkjet print-head for biofabrication

Integration of Biomechanical and Biological Characterization in the Development of Porous Poly(Caprolactone)-Based Membranes for Abdominal Wall Hernia Treatment.

AIMS: Synthetic meshes are the long-standing choice for the clinical treatment of abdominal wall hernias: the associated long-term complications have stimulated the development of a new-generation of bio-resorbable prostheses. In this work, polycaprolactone (PCL) porous membranes prepared by solvent casting/porogen leaching of PCL/poly(ethylene glycol) (PEG) blends with different compositions (different PCL/PEG weight ratio and PEG molecular weight) were investigated to be applied in the field. An optimal porous membrane structure was selected based on the evaluation of physicochemical, biomechanical and in-vitro biological properties, compared to a reference commercially available hernia mesh (CMC). FINDINGS: Selected PCL7-2i membranes (derived from PCL/PEG 70/30, PCL: Mw 70,000-90,000 Da; PEG: 35,000 Da) showed suitable pore size for the application, intermediate surface hydrophilicity and biomimetic mechanical properties. In-vitro cell tests performed on PCL7-2i membranes showed their cytocompatibility, high cell growth during 21 days, a reduced production of pro-inflammatory IL-6 respect to CMC and a significant secretion of Collagen Type I. CONCLUSIONS: PCL7-2i membranes showed biomimetic biomechanical properties and in-vitro biological properties similar to or even better than - in the case of anti-inflammatory behavior and collagen production - CMC, a commercially available product, suggesting potentially improved integration in the host tissue

Biological and Proteomic characterization of a composite mesh for abdominal wall hernia treatment: Reference Study

Aims: The industrial development of a product requires performing a deep analysis to highlight its characteristics useful for future design. The clinical use of a product stimulates knowledge improvement about it in a constant effort of progress. This work shows the biological characterization of CMC composite mesh. CMC polypropylene prosthesis was seeded with Human fibroblast BJ. Samples (cells and medium) were collected at different time points in order to perform different analysis: inflammatory markers quantification; collagens immunohistochemistry; matrix metalloproteinases zimography; extracellular matrix proteomic profile. Findings: CMC presented a good cell viability rate and cell growth during the 21 days. The inflammatory profile showed an initial secretion of anti-inflammatory IL-10 and a final increase of pro-inflammatory IL-6. Immunocytochemistry highlighted a similar Collagen type I/type III ratio. The proteomic analysis evidenced the ECM protein content profile composed, mainly, by collagens, fibronectin, laminin. MMPs resulted both expressed when in contact to mesh. Conclusions: CMC shows a good cell biocompatibility and growth. The increase of pro-inflammatory markers could stimulate proliferation, influencing the integration process in human body. Proteomics highlights the ECM modulation by CMC. An integrated investigation of these biological analyses with mechanical data should improve the design process of a new product