Funktionelle Konsequenzen von Mutationen im Melanocortin-4-Rezeptorgen bei adipösen Kindern und Jugendlichen

Der Melanocortin-4-Rezeptor spielt eine zentrale Rolle in der Gewichtsregulation, er vermittelt (indirekt) die anorexigenen Effekte des Leptin, indem er nach Aktivierung eine Einstellung der Nahrungsaufnahme und eine Erhöhung der Stoffwechselrate bedingt. Er ist der Familie der G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren zuzuordnen und koppelt an ein Gs-Protein, welches die Adenylylcyclase aktivieren kann. Das Rezeptorprotein besteht aus 332 Aminosäuren und wird durch ein einziges Exon in der humanen Chromosomen-region 18q22 kodiert. Den endogenen Agonisten am Melanocortin-4-Rezeptor stellt das alpha-MSH dar, welches dem Vorläuferprotein Proopiomelanocortin (POMC) entstammt. Zahlreiche Mutationen im MC4R-Gen konnten bis zum heutigen Tage gefunden werden, die Hoffnung, hierin eine Hauptursache für die extreme kindliche Adipositas gefunden zu haben, hat sich leider nicht bestätigen können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine sehr große Patientenpopulation (808 Kinder und Jugendlich mit einem durchschnittlichen BMI> 30 kg/m2), sowie deren Eltern auf Mutationen im Melanocortin-4-Rezeptor-Gen hin untersucht. Dabei ergab sich ein signifikant höherer Anteil von Trägern relevanter Mutationen als in der unter- bis normalgewichtigen Kontrollgruppe. Um die funktionelle Relevanz der 16 neu detektierten Mutationen untersuchen zu können, wurden diese zunächst in den Expressionsvektor pSG5 kloniert. Im Anschluss transfizierten wir COS7-Zellen mit den entsprechenden Proben und führten den cAMP-Akkumulations-Assay durch. Im Rahmen dieser Untersuchung zeigten die 16 Mutationen sehr unterschiedliche Verhaltensweisen. Ein Teil zeigte eine deutliche Reduktion der cAMP-Spiegel unter Stimulation mit alpha-MSH gegenüber denen des Wildtyp-Rezeptors. Ein anderer Teil zeigte Konzentrations-Wirkungskurven, die der des Wildtyps entsprachen. Zwei der von uns untersuchten Rezeptorvarianten (S127L und P230L) zeigten gar ohne Stimulation durch den entsprechenden Liganden Basalwerte, die weit über dem des Wildtyp-Allels lagen, so dass wir hier eine konstitutive Aktivität der Rezeptorproteine postulierten. Gerade die physiologische oder gar die gesteigerte Aktivität der veränderten Rezeptorproteine unter Agonisten-Stimulation lässt sich dabei nur schwer zur Erklärung des adipösen Phänotyps des betroffenen Probanden heranziehen. Der von uns ebenfalls im cAMP-Assay untersuchte, weit verbreitete Polymorphismus V103I zeigte in seiner Dosis-Wirkungskurve nur geringe Abweichungen von den Werten des Wildtyp-Rezeptors. Da sich ein Teil der Ausfälle in der Funktionalität bei Mutationen des MC4R-Gens durch einen gestörten Transport der veränderten Proteine in die Plasmamembran erklären lässt, untersuchten wir einige der Rezeptoren außerdem im Zelloberflächen-ELISA. Im ELISA ergab sich eine Reduktion der Oberflächen-expression der Mutationen G181D und S94R (welche bereits im cAMP-Assay einen totalen Funktionsausfall gezeigt hatten). Die von uns als konstitutiv aktiv deklarierten Rezeptorvarianten S127L und P230L zeigten jedoch wider Erwarten keinen behinderten Transport an die Zelloberfläche, im Gegenteil erschien die Zelloberflächen-Expression gegenüber der des Wildtyp-Rezeptors eher erhöht. Die restlichen im ELISA untersuchten Rezeptorvarianten zeigten eine ähnliche Expression an der Zelloberfläche wie der Wildtyp-MC4R. Auch der intrazelluläre Verbleib der veränderten Rezeptorproteine reicht hier also zur Klärung der Ursache der Fettsucht des betroffenen Patienten nicht aus. Die Frage, welche Bedeutung bestehenden Mutationen im Melanocortin-4-Rezeptor-Gen im Hinblick auf den adipösen Phänotyp des betroffenen Individuums zukommt, konnte von uns nur teilweise gelöst werden: Die Annahme eines autosomal dominanten Erbganges kann vor dem Hintergrund der Ergebnisse der funktionellen Untersuchungen (und vorheriger Beschreibungen schlanker, heterozygoter Träger funktionell relevanter Mutationen) eindeutig verneint werden. Aufgrund der Tatsache, dass in unserer Studienpopulation signifikant mehr Träger einer funktionell relevanten Mutation (15) auftraten (gegenüber keiner funktionell relevanten Mutation innerhalb der Kontrollgruppe) und alle funktionell relevanten Mutationen zudem von den Eltern auf ihre Kinder weitervererbt worden waren, konnten wir einen „major-gene-effect“ von funktionell relevanten MC4R-Varianten auf den Phänotyp des betroffenen Individuums postulieren. Da Melanocortin-4-Rezeptor-Mutationen jedoch nur für einen sehr geringen Prozentsatz der Adipositas-Fälle verantwortlich gemacht werden können, haben sie eine geringe epidemiologische, bei gleichzeitiger hoher individueller Relevanz

Signaltransduktion des Gq/11-gekoppelten GnRH-Rezeptors

Durch die Bindung an seinen spezifischen Rezeptor und die anschließende Aktivierung von ERK (exracellular signal-regulated kinase) trägt GnRH (gonadropin releasing hormone) zur Aufrechterhaltung der gonadotropen Funktion bei. Da der GnRH-Rezeptor ausschließlich mit Gq/11-Proteinen interagiert und die Rezeptorexpression ?-Arrestin-unabhängig erfolgt, bietet er sich für die systematische Aufschlüsselung zugrundeliegender Signalwege an. In gonadotropen ?T3-1-Zellen, welche den GnRH-Rezeptor endogen exprimieren, führte eine GnRH-Behandlung zu einer schnellen ERK-Aktivierung; diese wurde durch das Tyrphostin AG1478, einem spezifischen Inhibitor der EGFR(epidermal growth factor receptor)-Tyrosinkinase, inhibiert. In COS-7-Zellen, die den menschlichen GnRH-Rezeptor transient exprimieren, erfolgte die Agonisten-induzierte ERK-Aktivierung unabhängig von freien G??-Untereinheiten und konnte durch eine kurzzeitige Phorbolester-Behandlung nachgeahmt werden. Besonders bemerkenswert war, daß die Gq/11-induzierte ERK-Aktivierung durch N17-Ras und durch die Expression der C-terminalen Src-Kinase inhibiert werden konnte, aber auch durch weitere dominant negative Mutanten von Signalkomponenten wie Shc und dem EGF-Rezeptor, welche proximal von Ras lokalisiert sind. Sowohl GnRH als auch Phorbolester bewirkten in COS-7- und ?T3-1-Zellen eine Ras-Aktivierung, die von Src und der Tyrosinkinase des EGFR abhängig war; dies indiziert, daß beide Tyrosinkinasen distal der Proteinkinase C (PKC) und proximal von Ras agieren. Dessen ungeachtet war Src nicht an der Shc-Tyrosinphosphorylierung beteiligt. Die Behandlung mit GnRH oder Phorbolester führte zu einer PKC-abhängigen EGFR-Autophosphorylierung

Untersuchungen zur ligandenvermittelten Regulation der Melanocortin-Rezeptor-Aktivität

Die vorliegende Arbeit stellt die Ergebniss von Untersuchungen zur ligandenvermittelten Regulation der Melanocortin-Rezeptor-Aktivität dar. Melanocortin-Rezeptoren (MCR) spielen eine entscheidende Rolle in der Regulation des Energiehaushalts. Für den Melanocortin-4-rezeptor (MC4R) ist bekannt, dass er durch den agonisten alpha-MSH beta-arrestin-abhängig endozytiert. Gleiches konnte in dieser Arbeit auch für den Melanocortin-3-Rezeptor (MC3R) gezeigt werden. Von besonderer Bedeutung ist, dass auch der inversen Agonisten AgRP die Fähigkeit besitzt, den MC3R sowie den MC4R beta-Arrestin-abhängig zu endozytieren. Für die Mutante des MC4R, die MC4R-D90N, die ihre Fähigkeit an Galphas zu koppeln verloren hat, konnte zwar eine agonisten-abhängige beta-Arrestin Rekrutierung jedoch keine Endozytose gezeigt werden

Signalwege des TSH-Rezeptors - Gq/11-vermittelte Regulation von Metallothioninen in Schilddrüsenkarzinomzellen

Metallothionine (MT) sind cysteinreiche intrazelluläre Proteine, für die eine zytoprotektive Wirkung beschrieben wurde, da sie Zellen gegen Schwermetallionen und oxidativen Stress schützen. In früheren Untersuchungen wurde die Expression von Metallothioninen in normalen sowie neoplastischen Schilddrüsenzellen nachgewiesen. Die Regulation von MT in Schilddrüsenzellen ist jedoch weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von MT nach Thyreotropin-Stimulation in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen (FTC-133) und primären Schilddrüsenzellen (SD-191) untersucht. Mittels RT-PCR konnte nach TSH-Stimulation eine Dosis-abhängige Induktion der MT1-mRNA nachgewiesen werden. Um den Signalweg, der zu dieser vermehrten MT1-Transkription führt, genauer zu charakterisieren, wurden Schilddrüsenkarzinomzellen (FTC-133 Y601H) untersucht, welche mit einem mutierten TSH-Rezeptor (TSHR) transfiziert waren, der nicht in der Lage ist, das Gq/11-Protein zu binden. In diesen Zellen führt eine TSH-Stimulation zu einer Erhöhung der cAMP-Konzentration, wie sie auch in Zellen mit nicht-mutiertem TSHR zu finden ist. Ein Anstieg von Inositoltriphosphat (IP3) bleibt in den Zellen mit dem mutierten TSHR jedoch aus. Interessanterweise zeigte sich in FTC-133 Y601H Zellen keinerlei TSH-abhängige MT1-Induktion, was auf eine cAMP-unabhängige, jedoch Gq/11-abhängige Regulation von Metallothioninen schließen lässt. Dieses Ergebis wurde in weiteren Untersuchungen durch die Tatsache untermauert, dass in Schilddrüsenzellen mit intaktem TSHR die Induktion von MT durch Inhibition der Proteinkinase C (PKC) verhindert werden konnte, während sie durch direkte Stimulation der PKC mit einem Phorbolester gesteigert wurde. Weiter wurde die TSH-abhängige MT1-Expression auf Protein-Niveau mit Hilfe eines MT1-spezifischen Antikörpers überprüft. Auch hier wurde eine Hochregulation von MT1-Protein nach TSH-Stimulation in FTC-133-TSHR Zellen gefunden, welche im Vergleich dazu in FTC-133 Y601H Zellen wiederum fehlte. Unbekannt ist nun, welche Mechanismen zwischen der PKC-Aktivierung auf der einen Seite und der endgültigen Translation des MT1-Proteins auf der anderen Seite stehen. Hierfür wurde das Augenmerk auf die PKC abhängige Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors STAT gerichtet, welcher u.a. als MT-Transkriptionsfaktor beschrieben wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des STAT-Proteins in FTC-133 Zellen Gq/11-abhängig durch den TSHR reguliert wird. Diese Ergebnisse konnten in einem zweiten Zellsystem, primären Thyreozyten (SD-191), reproduziert werden. Diese SD-191 Zellen exprimieren endogen einen funktionstüchtigen TSHR. So kann man die Aktivierung von MT durch den TSHR in Schilddrüsenzellen nach heutigem Kenntnissstand wie beschrieben zusammenfassen.Somit konnte hier in einem Zellsystem, welches physiologischer Weise unter hohem oxidativen Stress steht, eine rezeptorvermittelte Induktion von einem antioxidativ wirkenden Protein genauer beschrieben werden. Interessant ist hierbei, dass der TSHR mit Hilfe von unterschiedlichen G-Proteinen oxidativ und antioxidativ wirkende Mechanismen gleichzeitig zu aktivieren scheint. Die hier vorgestellte Charakterisierung eines Gq/11-abhängigen Signalweges des TSHR zur Regulation von MT fügt den cAMP-unabhängigen Signalwegen des TSHR weitere Komplexität hinzu

Biophysikalischer Einfluss von Kv6.1-, Kv6.3- und Kv6.4-Proteinen auf den spannungsabhängigen Kaliumkanal Kv2.1

Zusammenfassung Spannungsabhängige Kaliumkanäle (Kv) nehmen Schlüsselfunktionen bei wichtigen physiologischen Prozessen in unterschiedlichsten Zelltypen ein. Zu diesen Prozessen gehören unter anderem die Bildung des Membranpotentials, die Erregbarkeit von Zellen oder der Ablauf des Aktionspotentials. Ein funktionsfähiger Kaliumkanal setzt sich dabei immer aus vier Untereinheiten zusammen und obwohl zahlreiche dieser Untereinheiten bekannt sind, besitzen nur relativ wenige von ihnen die Fähigkeit selbständig ein Tetramer zu formen. Bausteine dieser Art werden als α-Untereinheiten bezeichnet. Im Gegensatz hierzu können sich die sogenannten γ-Untereinheiten nur in Kombination mit α-Untereinheiten am Kanalaufbau beteiligen. Es wird angenommen, dass diese Heteromultimerisierung aus α- und γ-Proteinen das elektrophysiologische Verhalten des Kanals an die unterschiedlichen Anforderungen in den verschiedenen Zellen anpasst. Der genaue Ablauf der heteromeren Kanalbildung und die modifizierende Potenz vieler γ-Proteine sind bislang jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Auswirkungen von drei dieser modifizierenden γ-Proteine (Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4) auf die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften des humanen spannungsabhängigen Kaliumkanals hKv2.1 mit elektrophysiologischen Methoden näher untersucht. Das Aktivierungs-, Inaktivierungs- und Deaktivierungsverhalten wurde nach transienter Transfektion der cDNA von Kv2.1, Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4 in CHO-K1-Zellen mit Hilfe der patch-clamp-Technik analysiert. Da die γ-Proteine nicht in der Lage sind selbständig funktionsfähige Ionenkanäle zu bilden, zeigte sich bei Monotransfektion erwartungsgemäß keine eigenständige elektrische Aktivität. Bei Kotransfektion mit hKv2.1-Genen beteiligten sich die Kv6-Untereinheiten jedoch am Kanalaufbau und nahmen Einfluss auf das biophysikalische Verhalten des Ionenkanals. So wiesen die heteromeren Kanalkonstrukte von hKv2.1 mit Kv6.1, Kv6.3 oder Kv6.4 jeweils eigenständige elektrophysiologische Charakteristika auf, die sich von den Eigenschaften des homotetrameren hKv2.1-Kanals teils deutlich unterschieden. Zusammenfassend ergab sich für die hier untersuchten Mitglieder der Kv6-Familie folgendes Bild: 1.) Sie können keine homotetrameren Ionenkanäle bilden. 2.) Zusammen mit hKv2.1 entstehen funktionsfähige heteromere Kanalproteine. 3.) Die elektrophysiologischen Eigenschaften wie Aktivierung, Deaktivierung und Inaktivierung der Heteromere unterscheiden sich deutlich von den hKv2.1-Charakteristika. 4.) Die Kanalvielfalt und –funktionsweise wird durch heteromultimeren Aufbau beträchtlich erweitert. 5.) Zellen können sich mit diesen modifizierten Kanalkomplexen an die unterschiedlichen Anforderungen und Aufgaben in den verschiedenen Organen anpassen. 6.) Die Aufgaben der Kv6-Familie entsprechen daher einer regulatorischen und modifizierenden Komponente. Desweiteren wurden neue Erkenntnisse über den Vorgang der Multimerisierung gewonnen. Erkennung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten eines spannungsabhängigen Kaliumkanals zum arbeitenden Ionenkanal werden spezifisch über die sogenannte T1-Domäne mit der hochkonservierten Aminosäuresequenz HX5CX20CC vermittelt. Experimente mit dem Kanal hKv2.1H105V, bei dem die Aminosäure Histidin an der Position 105 durch Valin mittels gezielter Mutagenese ersetzt wurde, lieferten folgendes Ergebnis: Obwohl eine Tetramerisierung zum arbeitenden Kanal trotz Punktmutation möglich war, konnten sich Kv6.4-Untereinheiten nicht mehr daran beteiligen. Die Stromkinetik des hKv2.1H105V wurde anders als beim Wildtyp hKv2.1 durch Kotransfektion mit dem Kv6.4-Protein nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aminosäure Histidin im HX5CX20CC-Motiv für die Bildung von Heteromultimeren aus α- und γ-Proteinen eine essentielle Rolle spielt, während die Bildung von homotetrameren Kanälen, die nur aus α-Untereinheiten zusammengesetzt sind weiterhin möglich ist und unabhängig von Histidin verläuft. Diese Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis sowohl des Vorgangs als auch der Bedeutung der Multimerisierung bei spannungsabhängigen Kaliumkanälen

Die agonistunabhängige Rolle des Angiotensin II-Rezeptors AT1A in der arteriellen Vasoregulation

Die myogene Vasokonstriktion dient in Säugetieren der Aufrechterhaltung eines konstanten hydrostatischen Kapillardruckes zur Vermeidung von Ödemen. An isolierten Arterien kann die myogene Vasokonstriktion unabhängig von neuralen und hormonellen Einflüssen durch die Veränderung des intravaskulären Druckes ausgelöst werden. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle des (Angiotensin II)-Rezeptors AT1A in der arteriellen myogenen Vasokonstriktion. Mittels Druck-Myografie wurde im Rahmen dieser Arbeit die myogene Vasokonstriktion isolierter Mesenterial- und Zerebralarterien über einen physiologischen intravaskulären Druckbereich von 5 bis 160 mmHg gemessen. Es erfolgte der Vergleich der Stärke der myogenen Vasokonstriktion von AT1A-Rezeptor gendefizienten Mäusen im Gegensatz zu Gefäßen von gentechnisch unveränderten Mäusen mit gleichem genetischen Hintergrund. An Mesenterialarterien von AT1A-Rezeptor gendefizienten Mäusen konnte im Gegensatz zu Gefäßen von nicht gendefizienten Mäusen ein signifikant erniedrigter intravaskulärer Druck im Bereich von 120-160 mmHg nachgewiesen werden. Der größte Unterschied in der Stärke der myogenen Vasokonstriktion zwischen den Vergleichsgruppen lag bei absolut 17,9% (bei 160 mmHg) und relativ 46,6% (bei 150 mmHg). An Zerebralarterien konnte ein signifikant erniedrigter intravaskulärer Druck nur bei 50 und 60 mmHg nachgewiesen werden. Es erfolgte außerdem der Vergleich der pharmakainduzierten arteriellen Vasokonstriktion an Gefäßen von AT1A-Rezeptor gendefizienten und nicht gendefizienten Mäusen unter druckkonstanten Bedingungen. An Zerebralarterien aus AT1A-Rezeptor gendefizienten Mäusen zeigte sich eine signifikant erniedrigte Stärke der Angiotensin II-vermittelten Vasokonstriktion. Die pharmakavermittelte Vasokonstriktion konnte an isolierten Zerebralarterien in folgender Reihenfolge absteigender Stärke gemessen werden: Endothelin 1 > Phenylephrin > Angiotensin II > Vasopressin. An Mesenterialarterien konnte kein signifikanter Unterschied in der pharmakainduzierten Vasokonstriktion von AT1A-Rezeptor gendefizienten und nicht AT1A-Rezeptor gendefizienten Mäusen festgestellt werden. Auch die molekularbiologische Testung von gegen den AT1A-Rezeptor gerichteter siRNA wurde im Rahmen dieser Arbeit für eine spätere Anwendung im Tiermodell durchgeführt. Es erfolgte die Herstellung eines exprimierenden Plasmids, das eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) Sequenz des AT1A-Rezeptors, die an ein Fluoreszenzmolekül gekoppelt war, beinhaltete. Durch Einschleusung dieses Plasmids in Zellen und anschließende polyklonale und monoklonale Selektion konnte eine stabile, den AT1A-Rezeptor exprimierende Zelllinie hergestellt werden. Da im Plasmid die DNA-Sequenz des Rezeptors direkt mechanisch an die Sequenz des Fluoreszenzproteins gekoppelt war, diente die Abnahme der intrazellulären Fluoreszenz, im Vergleich zu unbehandelten den Rezeptor exprimierenden Zellen, als Maß für die Wirkstärke der siRNA in der Verminderung der Genexpression des AT1A-Rezeptors. Es konnte eine maximale prozentuale Wirkstärke der siRNA von 87,6% erreicht werden. Eine Zunahme der Wirkstärke ließ sich generell durch eine höhere Endkonzentration und eine längere Einwirkdauer der siRNA erzielen. Die druckmyografisch erhobenen Messungen dieser Arbeit zeigen, dass der AT1A-Rezeptor eine Rolle in der arteriellen myogenen Vasokonstriktion spielt. Durch Applikation der hier getesteten siRNA im Tiermodell könnten weitere Erkenntnisse zur Rolle des AT1-Rezeptors in der arteriellen Vasoregulation gewonnen werden

Einfluss des Glycosylierungsmusters auf die Basalaktivität von hTRPC3 und hTRPC6

An lebenswichtigen Prozessen wie Kognition, Atem- und Kreislaufregulierung sind Kanal-Proteine der transienten Rezeptorpotential-(TRP)-Superfamilie beteiligt. Beruhend auf Sequenzhomologien ihrer Aminosäurestruktur und funktionellen Ähnlichkeiten, kann die TRP-Superfamilie in mehrere Familien und Subfamilien unterteilt werden. Eine der ersten entdeckten Familien ist die TRPC („canonical“ oder „classical“)-Familie, die wiederum in vier Subfamilien unterteilt werden kann. Vertreter der beim Menschen vorkommenden (human, h) TRPC3,6,7-Subfamilie bilden rezeptor- oder speichergesteuerte, nicht-selektive Calcium leitende Kationen-Kanäle. hTRPC3, hTRPC6 und hTRPC7 können allesamt durch Diacylglycerol aktiviert werden. Jeweils vier Kanal-Proteine bilden mit sich selbst (Homotetramere) oder untereinander (Heterotetramere), aber nicht mit Vertretern anderer TRPC-Subfamilien funktionelle Kationen-Kanäle. Diese Ähnlichkeiten warfen die Frage auf, ob sich hTRPC3 und hTRPC6 in ihren biophysikalischen Eigenschaften gleichen und damit funktionell austauschbar, also redundant sind oder ob sie unterschiedliche zelluläre Funktionen besitzen. Zudem sollte geklärt werden, ob das extrazelluläre Glykosylierungsmuster vom hTRPC3 (eine Glykosylierungsstruktur auf der ersten extrazellulären Schleife) und hTRPC6 (jeweils eine Glykosylierungsstruktur auf den ersten beiden extrazellulären Schleifen, e1 und e2) biophysikalische Eigenschaften definiert. Mittels der Patch-Clamp-Technik in der Ganzzell- und Einzelkanalkonfiguration sowie mittels Erschaffung von Glykosylierungsmutanten der Wildtyp-Kanalproteine hTRPC3 und hTRPC6 konnten folgende Aussagen über die biophysikalischen Eigenschaften getroffen werden: 1. hTRPC3 bildet funktionelle Kanäle mit hoher konstitutiver Aktivität (Basalaktivität) und unterscheidet sich darin signifikant von hTRPC6 2. hTRPC6-N561Q (Elimination der Glykosylierungsstruktur auf e2) und hTRPC6-N473Q-N561Q (Elimination der Glykosylierungsstruktur auf e1 und e2) bilden wie hTRPC3 ebenfalls funktionelle Kationen-Kanäle mit hoher Basalaktivität und unterscheiden sich darin ebenfalls signifikant von hTRPC6 3. hTRPC3-E512N (Hinzufügen einer zweiten Glykosylierungsstruktur) bildet im Vergleich zu hTRPC3 funktionelle Kationen-Kanäle mit deutlich verringerter Basalaktivität 4. das Glycosylierungsmuster beeinflusst jedoch nicht die Aktivierung durch Agonisten (Histamin bzw. Carbachol in maximaler Wirkkonzentration) Das Glykosylierungsmuster entscheidet demnach über die konstitutive Aktivität funktioneller Kationen-Kanäle. hTRPC3 ist demnach konstitutiv hochaktiv. Die Aktivität von hTRPC6 ist dagegen fein reguliert. Beide zeigen unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften. Sie müssen demnach unterschiedliche zelluläre Funktionen ausüben

Pertussistoxin-sensitive Signalwege von alpha-MSH und AgRP an Melanocortin-4-Rezeptoren

Der Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GP- CR), dessen Signaltransduktion von zentraler Bedeutung für die Regulation der Körpergewichtshomöostase im Hypothalamus ist. Mutationen im MC4R sind die häufigste monogenetische Ursache für Adipositas. Bislang wurde die Signal- wirkung des MC4R ausschließlich seiner Gs-Kopplung und dadurch bedingten cAMP-Akkumulation zugeschrieben. Der endogene MC4R-Agonist „Ð-Melanozyten- stimulierendes Hormon“ (Ð-MSH) wirkt anorexigen über eine Gs-Protein-bedingte Steigerung der cAMP-Produktion. In Übereinstimmung hiermit ist die Mutation D90N des MC4R, welche keine Gs-Proteine aktiviert, assoziiert mit einer ausgepräg- ten Adipositas. Eine Besonderheit des MC4R ist das Vorkommen von endogenen Antagonisten: „Agouti-related Protein“ (AgRP) wirkt zum einen durch die Blockade der Ð-MSH-Wirkung indirekt orexigen, kann aber auch in Abwesenheit von Ð-MSH basale cAMP-Spiegel erniedrigen. Daher wird AgRP auch eine inverse agonistische Wirkung zugesprochen. Interessanterweise ist weder die physiologische Bedeutung dieser Wirkung bekannt, noch sind die dazu führenden Mechanismen verstanden. Zur Untersuchung der detaillierten molekularen Wirkung von Ð-MSH und AgRP auf den MC4R wurde die G-Protein-Aktivierung mittels GTPÒ35S-Assay, sowie die cAMP-Akkumulation mittels cAMP-Assay in HEK293-Zellen und GT1-7-Zellen un- tersucht. Überraschenderweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass neben Ð- 110 5. Zusammenfassung MSH auch AgRP G-Proteine aktiviert und somit agonistisch am MC4R wirkt. Diese AgRP-bedingte G-Protein-Aktivierung war PTX-sensitiv, welches die aktivierten G- Proteine als Gi/o-Proteine kennzeichnet. Auch die Aktivierung von PTX-sensitiven G-Proteinen an der Gs-defizienten D90N-Mutation belegt die Involvierung von Gi/o- Proteinen bei der Signaltransduktion des MC4R im Allgemeinen. Somit konnte in dieser Arbeit eine duale Kopplung des MC4Rs an Gi/o- und Gs-Proteine in einem endogenen Zellsystem etabliert werden. AgRP ist in der Lage selektiv Gi/o-Proteine zu aktivieren und damit aktiv, Ð-MSH-unabhängig die Körpergewichtshomöostase zu regulieren. Neben diesem wichtigen Befund für das Melanocortinsystem, besitzt die Definition der AgRP-Wirkung, als endogen vorkommender funktional selektiver Agonist an einem etablierten GPCR, große Bedeutung für das Verständnis dieser Rezeptorfamilie im Allgemeinen