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Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization
The PARKIN (PARK2) ubiquitin ligase and its regulatory kinase PINK1 (PARK6), often mutated in familial early onset Parkinsonâs Disease (PD), play central roles in mitochondrial homeostasis and mitophagy.1â3 While PARKIN is recruited to the mitochondrial outer membrane (MOM) upon depolarization via PINK1 action and can ubiquitylate Porin, Mitofusin, and Miro proteins on the MOM,1,4â11 the full repertoire of PARKIN substrates â the PARKIN-dependent ubiquitylome - remains poorly defined. Here we employ quantitative diGLY capture proteomics12,13 to elucidate the ubiquitylation site-specificity and topology of PARKIN-dependent target modification in response to mitochondrial depolarization. Hundreds of dynamically regulated ubiquitylation sites in dozens of proteins were identified, with strong enrichment for MOM proteins, indicating that PARKIN dramatically alters the ubiquitylation status of the mitochondrial proteome. Using complementary interaction proteomics, we found depolarization-dependent PARKIN association with numerous MOM targets, autophagy receptors, and the proteasome. Mutation of PARKINâs active site residue C431, which has been found mutated in PD patients, largely disrupts these associations. Structural and topological analysis revealed extensive conservation of PARKIN-dependent ubiquitylation sites on cytoplasmic domains in vertebrate and D. melanogaster MOM proteins. These studies provide a resource for understanding how the PINK1-PARKIN pathway re-sculpts the proteome to support mitochondrial homeostasis
AcetylierungsabhÀngige Regulierung des Notch-Signalwegs durch SIRT1
One of the key functions of blood vessels is to transport nutrients and oxygen to distant tissues and organs in the body. When blood supply is insufficient, new vessels form to meet the metabolic tissue demands and to re-establish cellular homeostasis. Expansion of the vascular network through sprouting angiogenesis requires the specification of ECs into leading (sprouting) tip and following (non-sprouting) stalk cells. Attracted by guidance cues tip cells dynamically extend and retract filopodia to navigate the nascent vessel sprout, whereas trailing stalk cells proliferate to form the extending vascular tube. All of these processes are under the control of environmental signals (e.g. hypoxia, metabolism) and numerous cytokines and peptide growth factors. The Dll4/Notch pathway coordinates several critical steps of angiogenic blood vessel growth. Even subtle alterations in Notch activity can profoundly influence endothelial cell behavior and blood vessel formation, yet little is known about the intrinsic regulation and dynamics of Notch signaling in endothelial cells. In addition, it remains an open question, how different growth factor signals impinging on sprouting ECs are coordinated with local environmental cues originating from nutrient-deprived, hypoxic tissue to achieve a balanced endothelial cell response. Acetylation of lysines is a critical posttranslational modification of histones, which acts as an important regulatory mechanism to control chromatin structure and gene transcription. In addition to histones, several non-histone proteins are targeted for acetylation reversible acetylation is emerging as a fundamental regulatory mechanism to control protein function, interaction and stability. Previous studies from our group identified the NAD+-dependent deacetylase SIRT1 as a key regulator of blood vessel growth controlling endothelial angiogenic responses. These studies revealed that SIRT1 is highly expressed in the vascular endothelium during blood vessel development, where it controls the angiogenic activity of endothelial cells. Moreover, in this work SIRT1 has been shown to control the activity of key regulators of cardiovascular homeostasis such as eNOS, Foxo1 and p53. The present study describes that SIRT1 antagonizes Notch signaling by deacetylating the Notch intracellular domain (NICD). We showed that loss of SIRT1 enhances DLL4-induced endothelial Notch responses as assessed by different luciferase responsive elements as well as transcriptional analysis of Notch endogenous target genes activation. Conversely, SIRT1 gain of function by overexpression of pharmacological activation decreases induction of Notch targets in response to DLL4 stimulation. We also showed that the NICD can be directly acetylated by PC AF and p300 and that SIRT1 promotes deacetylation of NICD. We have identified 14 lysines that are targeted for acetylation and their mutation abolishes the effects of SIRT1 of Notch responses. Furthermore, over-expression or activation of SIRT1 significantly reduces the levels of NICD protein. Moreover, SIRT1-mediated NICD degradation can be reversed by blockade of the proteasome suggesting a mechanism resulting from ubiquitin-mediated proteolysis. Indeed, we have shown that SIRT1 knockdown or pharmacological inhibition decreased NICD ubiquitination. We propose a novel molecular mechanism of modulation of the amplitude and duration of Notch responses in which acetylation increases NICD stability and therefore permanence at the promoters, while SIRT1, by inducing NICD degradation through its deacetylation, shortens Notch responses. In order to evaluate the physiological relevance of our findings we used different models in which the Notch functions during blood vessel formation have been extensively characterized. First, retinal angiogenesis in mice lacking SIRT1 activity shows decreased branching and reduced endothelial proliferation, similar to what happens after Notch gain of function mutations. ECs from these mice exhibit increased expression of Notch target genes. Second, these results were reproducible during intersomitic vessel growth in sirt1-deficient zebrafish. In both models, the defects could be partially rescued by inhibition of Notch activation. Third, we used an in vitro model of vessel sprouting from differentiating embryonic bodies in response to VEGF in a collagen matrix. Our results showed that Sirt1-deficient cells shows impaired sprouting which correlated with increased NICD levels. In addition, when in competition with wild-type cells in this assay, Sirt1-deficient cells are more prone to occupy the stalk cell position. Taken together, our study identifies reversible acetylation of NICD as a novel molecular mechanism to adapt the dynamics of Notch signaling and suggest that SIRT1 acts as a rheostat to fine-tune endothelial Notch responses. The NAD+-dependent feature of SIRT1 activity possibly links endothelial Notch responses to environmental cues and metabolic changes during nutrient deprivation in ischemic environments or upon other cellular stresses.Das Wachstum von BlutgefĂ€Ăen ist entscheidend fĂŒr die embryonale Entwicklung, das Wachstum des Organismus sowie die Reparatur von Gewebe wĂ€hrend der postnatalen Entwicklung. Um sicherzustellen, dass jede Zelle wĂ€hrend des Wachstums und der Geweberegeneration ausreichend mit Sauerstoff und NĂ€hrstoffen versorgt wird, bildet der Organismus neue BlutgefĂ€Ăe, um den metabolischen Anforderungen des Gewebes gerecht zu werden. Die innerste Zellschicht der BlutgefĂ€Ăe, das Endothel, spielt fĂŒr die Bildung und das Wachstum neuer BlutgefĂ€Ăe eine entscheidende Rolle - ein Prozess, der als Angiogenese bezeichnet wird. Um ein komplexes GefĂ€Ănetzwerk ausbilden zu können, mĂŒssen Endothelzellen Aussprossung, Migration und Proliferation in einer zeitlich und örtlich geordneten Weise koordinieren. Neuere Untersuchungen konnten zeigen, dass das angiogene Wachstum neuer GefĂ€Ăe eine Spezifikation der Endothelzellen in sogenannte âTip-â und âStalk-Zellenâ erfordert. Tip-Zellen finden sich an der Spitze auswachsender GefĂ€ĂsproĂe, bilden eine Vielzahl von Filopodien und navigieren das BlutgefĂ€Ăwachstum. Stalk-Zellen hingegen bilden deutlich weniger Filopodien, proliferieren, folgen den Tip-Zellen und ermöglichen so das geordnete Auswachsen der BlutgefĂ€sse. Die Notch-Signalkaskade ist ein evolutionĂ€r hoch konservierter, inter-zellulĂ€rer Kommunikationsmechanismus, der die Differenzierung verschiedener Zelltypen kontrolliert. Untersuchungen der letzten Jahre haben ergeben, dass zentrale Prozesse des BlutgefĂ€Ăwachstums, wie zum Beispiel die Spezifizierung der Tip- und Stalk-Zellen entscheidend durch den Notch-Signalweg kontrolliert werden. Bereits geringste VerĂ€nderungen der endothelialen Notch-AktivitĂ€t fĂŒhren zu tiefgreifenden Störungen des Endothelzellverhaltens und der BlutgefĂ€Ăbildung und genetische Mutationen in Komponenten der Signalkaskade sind fĂŒr eine Mehrzahl von vaskulĂ€ren Pathologien verantwortlich. Trotz der Erkenntnis, dass der Notch-Signalweg eine essentielle Bedeutung fĂŒr das Wachstum und die Homöostase der BlutgefĂ€Ăe spielt, ist ĂŒber die Regulation und die Dynamik der Notch-Kaskade in Endothelzellen sehr wenig bekannt. Die Acetylierung der AminosĂ€ure Lysin ist eine wichtige post-translationale Modifikation von Histon-Proteinen und spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der Chromatin-Struktur sowie der transkriptionellen Genregulation. Neure Studien haben jedoch gezeigt, dass nicht nur Histon-Proteine acetyliert werden, sondern ebenfalls eine Vielzahl von nukleĂ€ren und zytoplasmatischen Nicht-Histon-Proteinen, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, Co-Faktoren und Enzyme. Die reversible Acetylierung ist ein grundlegender Mechanismus ĂŒber den Proteineigenschaften durch Ănderung der Proteinbindung, AktivitĂ€t, Lokalisation und StabilitĂ€t auf unterschiedliche Weise beeinflusst werden können. Der Prozess der reversiblen Acetylierung ist dynamisch und wird von entgegengesetzt agierenden (Histon-) Acetyltransferasen und (Histon-) Deacetylasen kontrolliert. Die Regulation der antagonistischen AktivitĂ€ten dieser Enzyme dient als zentraler Mechanismus die Genexpression zu balancieren sowie der AktivitĂ€t verschiedener zellulĂ€rer Signalkasaden zu steuern. Sirtuin-1 (SIRT1) ist eine NAD+-abhĂ€ngige Proteindeacetylase, die der Familie der Sirtuine angehört. FrĂŒhere Studien unserer Arbeitsgruppe konnten bereits eine essentielle Funktion von SIRT1 in der postnatalen Angiogenese aufzeigen. Ein erster Hinweis auf eine molekulare Verbindung zwischen SIRT1 und dem Notch-Signalweg resultierte aus der experimentellen Beobachtung, dass sirt1-defiziente Zebrafische Störungen der GefĂ€Ăbildung aufwiesen, die ein hohes MaĂ an Ăhnlichkeit mit Zebrafisch-Mutanten aufweisen, die durch eine erhöhte Notch-AktivitĂ€t charakterisiert sind. Vor dem Hintergrund dieser Befunde untersuchten wir die Bedeutung der Metabolismusund Redox-sensitiven Deacetylase SIRT1 fĂŒr die Regulation des endothelialen Notch-Signaling. Reportergen-Studien sowie qPCR-Analysen mit Notch-regulierten Genen zeigten, dass die gezielte Ausschaltung von SIRT1 mittels âsmall interfering RNAâ (siRNA) in kultivierten Endothelzellen keinen Einfluss auf basale Notch-AktivitĂ€t hatte, jedoch zu einer signifikanten VerstĂ€rkung der Notch-AktivitĂ€t nach Stimulation mit dem Notch-Liganden DLL4 fĂŒhrte. Im Gegensatz dazu hatte die pharmakologische Aktivierung von SIRT1 in Endothelzellen mit dem âsmall molecule activatorâ SRT2183 eine deutliche Hemmung der DLL4-induzierten Notch-AktivitĂ€t zur Folge, so dass eine hemmende Funktion von SIRT1 in der Notch-Signalkaskade vermutet werden konnte. Dieser inhibierende EinfluĂ von SIRT1 auf den Notch-Signalweg war nicht durch eine verminderte mRNA Expression der Notch Rezeptoren oder anderer entscheidender Komponenten des Signalwegs bedingt (z.B. NOTCH1, NOTCH4, MAML, NCoR), da die RNA Interferenz-vermittelte Reduktion von SIRT1 keinen signifikanten Einfluss auf die basale Expression dieser Gene hatte. Stattdessen fĂŒhrte der siRNA-induzierte Knockdown von SIRT1 zu einer deutlich gesteigerten Notch-AktivitĂ€t, wenn die intrazellulĂ€re DomĂ€ne des Notch1 Rezeptors (NICD) in SIRT1-defiziente Endothelzellen co-transfiziert wurde. Passend zu einem repressiven EinfluĂ von SIRT1 auf die Notch-AktivitĂ€t, konnte die NICD-induzierte Notch-Antwort in Endothelzellen dosisabhĂ€ngig durch Ăberexpression von SIRT1 blockiert werden. Diese Befunde legen nahe, dass SIRT1 den Notch-Signalweg auf Ebene der NICD moduliert. Der hemmende Einfluss von SIRT1 auf die endotheliale Notch-AktvitĂ€t erforderte zudem die Deacetylase-AktivitĂ€t von SIRT1, da eine katalytisch inaktive SIRT1 Mutante keine Einfluss auf das Notch-Signaling hatte. Die Summe dieser Befunde zeigt, dass der endotheliale Notch-Signalweg nur durch SIRT1 beeinflusst wird, wenn Endothelzellen mit aktivierenden Notch-Liganden, wie zum Beispiel DLL4, angeregt werden und lĂ€sst einen post-transkriptionellen Regulationsmechanismus vermuten, der die Deacetylase-Funktion von SIRT1 erfordert. In biochemischen Analysen zeigte sich, dass der SIRT1-abhĂ€ngigen Regulation des Notch-Signalwegs eine Protein-Protein-Interaktion zwischen SIRT1 und NICD zugrunde liegt, die eine unversehrte SIRT1 Deacetylase-DomĂ€ne erforderte. Interessanterweise war jedoch eine ausgeprĂ€gte Verminderung der NICD Proteinexpression zu beobachten, wenn NICD mit SIRT1 co-exprimiert wurde, ohne das VerĂ€nderungen der Notch1 mRNA Expression verzeichnet werden konnten. Auf Grundlage dieser Befunde kann spekuliert werden, dass SIRT1 die Protein-StabilitĂ€t der NICD verĂ€ndert. Da die Deacetylase-DomĂ€ne von SIRT1 fĂŒr die Interaktion mit NICD notwendig war, wurde weiterhin untersucht, ob NICD selbst ein acetyliertes Nicht-Histon-Protein ist. Untersuchungen mit den Notch-assozierten Acetyltransferasen p300 und PCAF ergaben, dass NICD deutlich und dosisabhĂ€ngig durch sowohl p300 als auch PCAF acetyliert werden kann. In Ăbereinstimmung mit dem Modell einer reversiblen Acetylierung, fĂŒhrte die pharmakologische und genetische Hemmung der SIRT1 AktivitĂ€t zu einem deutlichen Anstieg des NICD Acetylierungsniveaus. DarĂŒber hinaus verhinderte die Ăberexpression von SIRT1 die p300-vermittelte Acetylierung der NICD und konnte in einem biochemischen Deacetylierungs-Assay mit rekombinanten Proteinen die NICD direkt deacetylieren. Diese Daten illustrieren die reversible Acetylierung der NICD und identifizieren SIRT1 als bedeutsame NICD-Deacetylase. Um die acetylierten Lysinreste der NICD zu identifizieren, wurden massenspektrometrische Untersuchungen durchgefĂŒhrt. Diese Untersuchungen ergaben, dass 14 hochkonservierte Lysinreste der NICD acetyliert werden können. Die Mutation dieser Lysine zu Arginin hatte eine nahezu vollstĂ€ndige Hemmung der NICD Acetylierung zur Folge. DarĂŒber hinaus war diese Acetylierungs-defiziente NICD Mutante resistent gegenĂŒber der SIRT1-vermittelten Regulation des Notch-Signalwegs. Diese Beobachtungen unterstreichen die molekulare Bedeutung der NICD Acetylierung und lassen vermuten, dass eine Reihe von Lysin-AminosĂ€uren der NICD fĂŒr die negative Regulation der Notch-Kaskade durch SIRT1 erforderlich ist. Da bekannt ist, dass NICD ein kurzlebiges Protein ist, welches durch eine Ubiquitinvermittelte Degradation abgebaut wird und Acetylierung von Lysinen die Ubiquitinierung von Proteinen beeintrĂ€chtigen kann, wurde die Auswirkungen von SIRT1 auf den UbiquitinabhĂ€ngigen Abbau des NICD Proteins untersucht. In Ăbereinstimmung mit vorhergehenden Analysen, wurde eine starke Ubiquitinierung der NICD bereits unter Kontrollbedingungen beobachtet. Die Hemmung der SIRT1 AktivitĂ€t durch den pharmakologischen Sirtuin-Inhibitor Nicotinamid (NAM) oder durch RNA Interferenz resultierte jedoch in einer deutlich verminderten Ubiquitinierung der NICD, was darauf hindeutet, dass SIRT1 die Ubiquitinierung der NICD beeinflusst. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen daher, dass NICD ein acetyliertes Protein ist und, dass die NICD-Acetylierung die Signalamplitude und Dauer der Notch-Antworten durch VerĂ€nderung des NICD Proteinumsatz steuert. SIRT1 wiederum agiert als NICD-Deacetylase, die der Acetylierungsinduzierten Proteinstabilisierung der NICD entgegenwirkt, um die SignalstĂ€rke und Dauer der Notch-Antwort zu limitieren. Um festzustellen, ob dieser neue molekulare Mechanismus der Notch-Regulation durch SIRT1 auch in vivo von physiologischer Bedeutung ist, wurde die katalytische DomĂ€ne von Sirt1 spezifisch in Endothelzellen durch eine Cre / loxP-vermittelte Exzision inaktiviert und die postnatale GefĂ€Ăneubildung in der Retina als etabliertes Modell-System des Dll4/Notch-Signalwegs untersucht. ImmunfluoreszenzfĂ€rbungen demonstrierten, dass die Sirt1 Proteinexpression besonders ausgeprĂ€gt im Bereich der angiogenen Front des GefĂ€Ăsystems ist. Interessanterweise war die Sirt1 Expression vor allem Stalk-Zellen prominent. Im Vergleich zu Kontroll-MĂ€usen fand sich in endothel-spezifischen Sirt1 MutantenmĂ€usen eine deutlich verzögerte Expansion des GefĂ€Ăplexus sowie eine signifikante Reduktion der GefĂ€Ădichte und der Endothelproliferation. Diese strukturellen VerĂ€nderungen des sich entwickelnden GefĂ€Ănetzwerks der Retina weiĂt verblĂŒffende Ăhnlichkeit mit der defekten GefĂ€Ăbildung in Mausmutanten auf, die durch eine erhöhte Notch-AktivitĂ€t in endothelialen Stalk-Zellen bedingt sind. In Ăbereinstimmung mit diesen Befunden wiesen aus Sirt1-defizienten MĂ€usen gewonnene Endothelzellen eine deutlich gesteigerte Expression verschiedener direkter Notch-Zielgene nach Stimulation mit DLL4 auf. Diese Daten suggerieren, dass SIRT1 als bedeutsamer negativer Modulator des Notch-Signalwegs wĂ€hrend der Angiogenese fungiert, dessen Ausschaltung zu einer deutlich gesteigerten Notch-AktivitĂ€t fĂŒhrt sowie einem gestörten GefĂ€Ăwachstum fĂŒhrt. Um zu untersuchen, ob eine Hemmung des Notch-Pathway die gestörte GefĂ€Ăneubildung in den endothel-spezifischen Sirt1 MutantenmĂ€use aufheben kann, wurden diese Tiere mit dem pharmakologischen Notch Inhibitor DAPT behandelt. Wie in vorherigen Studien berichtet, induzierte die Behandlung von Kontrolltieren mit DAPT ein stark verdichtetes, ĂŒbermĂ€Ăig verzweigtes sowie unkoordiniert auswachsendes BlutgefĂ€Ănetzwerk. Nach Behandlung mit DAPT entwickelten die Sirt1 Mutanten ein mit den Kontroll-MĂ€usen vergleichbares AusmaĂ der GefĂ€Ădichte und GefĂ€Ăverzweigung. Diese Befunde deuteten darauf hin, dass die Reduktion der GefĂ€Ădichte sowie die verminderte KomplexitĂ€t des GefĂ€Ăplexus in den Sirt1- defizienten MĂ€usen Folge einer erhöhten Notch-AktivitĂ€t ist. In Analogie zu diesen Befunden rief sowohl der Knockdown der sirt1 Expression mittels spezifisch gegen sirt1 gerichteten Antisense-Morpholino-modifizierten Oligonukleotiden als auch die endothel-spezifische Expression einer dominant negativen SIRT1 Mutante Defekte in der IntersegmentalgefĂ€Ăbildung des Zebrafisch hervor, die stark an Notch-induzierte Fehlbildungen im Zebrafisch erinnerten. Diese Störung der GefĂ€Ăentwicklung in sirt1- defizienten Zebrafischen gingen in der Tat mit einer vermehrten Notch-AktivitĂ€t in den GefĂ€Ăen des Zebrafish einher. So fĂŒhrte der Morpholino-induzierte Knockdown von sirt1 zu einer signifikant gesteigerten GFP Expression in Embryonen der transgenen Notch-Reporterlinie Tg(tp1bglob:EGFP), die indikativ fĂŒr erhöhte Notch-AktivitĂ€t in dieser transgenen Linie ist. Weiterhin konnte die gestörte GefĂ€Ăentwicklung in den sirt1-defizienten Zebrafischen durch Behandlung mit dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT oder durch Knockdown des arterien-spezifischen Notch-Liganden dll4 zu einem wesentlichen Anteil normalisiert werden. Diese Befunde legen nahe, dass eine Fehlregulation der endothelialen Notch-AktivitĂ€t eine zentrale Ursache fĂŒr die strukturellen GefĂ€Ădefekte der sirt1-defizienten Zebrafische ist. Zur weiteren Beurteilung der Auswirkungen von SIRT1 auf Notchkontrollierte Endothelfunktionen wurde die endotheliale Ausprossung und Proliferation untersucht in vitro untersucht. Kontroll-Endothelzellen bildeten kapillar-Ă€hnliche Aussprossungen in einer dreidimensionalen Kollagen-Matrix. Im Gegensatz dazu fĂŒhrte die siRNA-vermittelte Reduktion der SIRT1 Expression zu einer deutlichen Hemmung der Aussprossungen, mit Verminderung der Anzahl und LĂ€nge der Endothelsprossen. Dieses gestörte Aussprossungsverhalten der SIRT1-defizienten Endothelzellen konnte durch gleichzeitige Behandlung mit dem pharmakologischen Notch Inhibitor DBZ aufgehoben werden. In gleicher Weise wurde die DLL4-induzierte Hemmung der endothelialen Proliferation durch Ausschaltung von SIRT1 verstĂ€rkt, und durch Notch-Hemmung wiederhergestellt. Um schlieĂlich zu untersuchen, ob SIRT1 zell-autonom Notch-Antworten in Endothelzellen moduliert, wurde ein in vitro Model verwendet, in dem differenzierende embryonale Stammzellen der Maus (Embryoid Bodies, EBs) hierarchisch angeordnete GefĂ€Ănetze nach Stimulation mit VEGF in einer DLL4/Notch-abhĂ€ngingen Weise ausbilden. Kontroll-EBs entwickelten komplexe und hoch verzweigte GefĂ€Ănetze. Die Inaktivierung von Sirt1 durch genetische Deletion der katalytischen DomĂ€ne resultierte in einem stark reduzierten Wachstum von GefĂ€Ă-artigen Strukturen und verminderte die GefĂ€Ădichte. In chimĂ€ren EBs, die aus einer 1:1-Mischung von Sirt1 Wildtyp und Sirt1 mutierten Zellen bestanden, konnte eine partielle Wiederherstellung der angiogenen AktivitĂ€t erzielt werden. In Ăbereinstimmung mit der Modellvorstellung, das eine Sirt1-Defizienz zu einer Sensitivierung gegenĂŒber DLL4/Notch Signalen fĂŒhrt, fand sich in Sirt1 mutierten Zellen eine signifikant erhöhte Proteinexpression der NICD. Dieses erhöhte Expressionsniveau der NICD in Sirt1-defizienten Zellen war ebenfalls mit einer vornehmlichen Anordnung dieser Zellen in der âStalkâ-Position der neugebildeten GefĂ€Ăe assoziiert. Aus diesen Resultaten schlieĂen wir, dass SIRT1 als zell-autonomer negativer Modulator des Notch-Signalwegs in Endothelzellen agiert. Diese Studien etablieren daher eine zuvor unbekannte regulatorische Rolle von SIRT1 in der Notch-Signalkaskade und identifizieren die reversible Acetylierung der NICD als einen zentralen molekularen Mechanismus, die Dynamik der Notch-AktivitĂ€t zu kontrollieren