Utilisation des cellules souches humaines à pluripotence induite normales et mutantes pour l’étude et le traitement des surdités génétiques

Chez l’homme, la perte de cellules cochléaires est irréversible et conduit à la surdité neurosensorielle. Le syndrome d’Alström (ALMS) est une maladie génétique, autosomale récessive, caractérisée par de nombreux symptômes dont la surdité. La protéine mutée ALMS1 est responsable de la maladie et cette protéine est exprimée au niveau du centrosome des cellules en prolifération et au corps basal des cellules ciliées et de soutien. Pour développer un modèle cellulaire le plus proche de la pathologie humaine, notre projet est basé sur l’utilisation de cellules souches humaines à pluripotence induite (hiPS) normales ou mutantes. Nous avons généré pour la première fois des hiPS ALMS à partir de fibroblastes de patient ALMS sourds. Les propriétés essentielles d’auto-renouvèlement et de pluripotence de ces cellules ont été validées.Récemment, il a été démontré que les cellules souches embryonnaires humaines (hES) et murines (mES) peuvent se différencier in vitro en cellules cochléaires. A partir de cellules hiPS saines, nous avons développé un protocole de différenciation et obtenu en une population homogène de cellules ayant un parton d’expression protéique et géniques correspondant à celui des progéniteurs otiques (hOSCs). Lorsque ces cellules sont cultivées en présence de cellules nourricières, les hOSCs sont capables de générer des cellules ciliées. Nous avons appliqué le protocole de différenciation aux hiPS ALMS et observé des défauts de prolifération et de cycle cellulaire aux différents stades de différenciation (hiPS, hOSCs et après différenciation).Les résultats obtenus à partir des cellules ALMS différenciées suggèrent que leur potentiel de différenciation en cellules ciliées n’est pas affecté comme suggéré par Jagger et al. et Nodal et al. Cependant, les cellules hOSCs ALMS développe un cil primaire plus court. Nous avons également observé des défauts de proliférations et de cycle cellulaire entre cellules saines et mutées à différents stade de différenciation. Nous avons également remarqué une diminution de cohésion des centrosomes dans les cellules ALMS qui pourrait expliquer la diminution de prolifération et l’arrêt en G1 des hOSCs mutées. Nous émettons l’hypothèse que les progéniteurs otiques mutés entrent en sénescence et qu’un nombre réduit de cellules ciliées se développent correctement. Ces hypothèses permettraient d’expliquer la surdité précoce des patients ALMS.Enfin, pour exclure les biais de différenciation dus à l’origine différentes des cellules hiPS saine et pathologique, nous voulons corriger la mutation présente dans les hiPS par la technique de l’édition du génome (CRISPR/CAS). La génération d’une lignée isogénique à partir d’hiPS ALMS nous permettra de confirmer les phénotypes observés et de les relier à la mutation de la protéine ALMS1. A terme, la génération de la lignée isogénique nous fournira un modèle humain et inépuisable pour l’étude plus approfondie du syndrome d’Alström

Derivation of cochlear cells from pathological or isogenic human iPSCs for modeling hereditary hearing loss

Alström Syndrome (AS) is a human autosomal recessive genetic disorder characterized by numerous clinical symptoms including deafness. AS is caused by mutations in the ALMS1 gene encoding for ALMS1 protein expressed at the basal body and implicated in ciliogenesis, cell cycle and proliferation (Jagger et al., 2011; Zulato et al., 2011 & Shenje et al., 2014). We are interesting in understanding the unknown mechanisms involving this protein in the genetic deafness of AS patients. To develop a model as closer as possible to the human pathology, we are using human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) generated from fibroblasts of healthy and AS patients. Using a stepwise protocol, we demonstrated that healthy hiPSCs (waiting for isogenic hiPSCs) can generate a population of cells with gene and protein expression patterns consistent with the ones of otic progenitor cells (OSCs). At this differentiation stage, we observed some proliferation and apoptotic defects between healthy and AS cells. When human OSCs are co-cultured with mouse feeder cells, they are able to differentiate into hair cells (HCs). We successfully differentiated AS hiPSCs generated from AS patients into HCs. We are currently confirming gene expression pattern and testing HCs functionality.  To exclude patient linked epigenetics and differentiation defects, we are correcting the genomic mutation in the AS hiPSCs to generate isogenic hiPSCs using the CRIPSR/Cas9 system. Thanks to the isogenic hiPSCs we will be able to confirm that these defects are well due to the ALMS1 mutation.Derivation of cochlear cells from pathological or isogenic human iPSCs for modeling hereditary hearing los

Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.

Genome engineering and human iPS cells are two powerful technologies, which can be combined to highlight phenotypic differences and identify pathological mechanisms of complex diseases by providing isogenic cellular material. However, very few data are available regarding precise gene correction in human iPS cells. Here, we describe an optimized stepwise protocol to deliver CRISPR/Cas9 plasmids in human iPS cells. We highlight technical issues especially those associated to human stem cell culture and to the correction of a point mutation to obtain isogenic iPS cell line, without inserting any resistance cassette. Based on a two-steps clonal isolation protocol (mechanical picking followed by enzymatic dissociation), we succeed to select and expand corrected human iPS cell line with a great efficiency (more than 2 % of the sequenced colonies). This protocol can also be used to obtain knock-out cell line from healthy iPS cell line by the NHEJ pathway (with about 15 % efficiency) and reproduce disease phenotype. In addition, we also provide protocols for functional validation tests after every critical step

Using human pluripotent stem cells to untangle neurodegenerative disease mechanisms

Human pluripotent stem cells, including embryonic (hES) and induced pluripotent stem cells (hiPS), retain the ability to self-renew indefinitely, while maintaining the capacity to differentiate into all cell types of the nervous system. While human pluripotent cell-based therapies are unlikely to arise soon, these cells can currently be used as an inexhaustible source of committed neurons to perform high-throughput screening and safety testing of new candidate drugs. Here, we describe critically the available methods and molecular factors that are used to direct the differentiation of hES or hiPS into specific neurons. In addition, we discuss how the availability of patient-specific hiPS offers a unique opportunity to model inheritable neurodegenerative diseases and untangle their pathological mechanisms, or to validate drugs that would prevent the onset or the progression of these neurological disorders

Dopaminergic neurons differentiating from LRRK2 G2019S induced pluripotent stem cells show early neuritic branching defects.

Some mutations of the LRRK2 gene underlie autosomal dominant form of Parkinson's disease (PD). The G2019S is a common mutation that accounts for about 2% of PD cases. To understand the pathophysiology of this mutation and its possible developmental implications, we developed an in vitro assay to model PD with human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) reprogrammed from skin fibroblasts of PD patients suffering from the LRKK2 G2019S mutation. We differentiated the hiPSCs into neural stem cells (NSCs) and further into dopaminergic neurons. Here we show that NSCs bearing the mutation tend to differentiate less efficiently into dopaminergic neurons and that the latter exhibit significant branching defects as compared to their controls