Molecular markers for genetic diversity and phylogeny research of Brazilian sheep breeds

Brazilian sheep descended from several breeds brought to the New World by Portuguese and Spanish colonists, and they have evolved and adapted to local climatic variations and acquired tolerance or resistance to many diseases. Molecular markers are widely used in analyzing genetic variability, and markers such as amplified fragment length polymorphism (AFLP), restriction fragment length polymorphism (RFLP), microsatellite, mtDNA and single nucleotide polymorphism (SNP) have facilitated the characterization of genetic diversity and population structure, and in the investigation of the natural history, behavior, and evolution of several sheep breeds. In this context, we present here a review of the uses of molecular markers in ecological and conservation research of Brazilian sheep breeds.Key words: DNA polymorphism, genetic conservation, Ovis aries

Discriminação alélica em ovinos naturalizados do Pantanal Sul-Matogrossense por meio de marcadores microssatélites

The molecular biology techniques that are used in allelic discrimination for individual and sheep breedscharacterization are important tools in breeding programs and conservation of genetic resources. The use ofmicrosatellite markers allows allelic differentiation, which in turn allows us to infer the genetic variability of samplepopulations. The study aimed to test the sensitivity and efficiency of fluorescent capillary electrophoresis, using microsatellite primers, for allelic discrimination of the Crioulo breed from Pantanal sul-matogrossense, as well asverify the possibility of using the products of sequencing in genetic variability analysis. For this test, were used bloodsamples from Pantaneira breed sheep. The allelic discrimination of eight microsatellites was determined by capillaryelectrophoresis in automatic sequencer and the results analyses were performed on the programs CERVUS andDendro-UPGMA. The results indicated the possibility of using this technique for the individual genotyping of all locitested in electrophoretic analysis and its potential to allelic discrimination even in case of difference between twopairs of bases between the alleles. The resulting dendrogram based on the distance matrix by the UPGMA assemblymethod, indicated medium similarity coefficient of 0.72 in the group of animals. It was concluded that there is theviability and efficiency of the microsatellite molecular markers technique using capillary electrophoresis for allelicdiscrimination and the utility of results for studies of genetic variability, paternity diagnosis and characterization ofthe Crioulo sheep herd from Pantanal sul-matogrossense. As técnicas de biologia molecular que são utilizadas na discriminação alélica para caracterização individual e de raçasde ovinos são ferramentas importantes nos programas de melhoramento genético e de conservação de recursosgenéticos. A utilização de marcadores moleculares microssatélites possibilita a diferenciação alélica, que por sua vezpermite inferir a variabilidade genética de populações amostrais. O estudo teve como objetivo testar a sensibilidade ea eficiência da eletroforese capilar fluorescente, utilizando oligonucleotídeos iniciadores de microssátelites, paradiscriminação alélica da raça crioula do pantanal sul-matogrossense, bem como verificar a possibilidade de utilizaçãodos produtos do sequenciamento em análises de variabilidade genética. Para o referido teste foram utilizadas amostrasde sangue provenientes de ovinos da raça pantaneira. A discriminação alélica dos oito microssatélites foi determinadapor meio de eletroforese capilar em sequenciador automático e as análises dos resultados foram realizadas nosprogramas CERVUS e Dendro-UPGMA. Os resultados indicaram a possibilidade da utilização da técnica para agenotipagem individual de todos os loci testados numa corrida eletroforética e a sua potencialidade paradiscriminação alélica mesmo em situações de diferença de dois pares de bases entre os alelos. O dendrogramaresultante baseado na matriz de distância pelo método de agrupamento UPGMA, indicou coeficiente de similaridademédio de 0.72 no grupo de animais. Foi possível concluir que existe viabilidade e eficiência da técnica de marcadoresmoleculares microssatélites utilizando eletroforese capilar para discriminação alélica e a utilidade dos resultados paraestudos de variabilidade genética, diagnóstico de paternidade e caracterização do rebanho de ovinos crioulos doPantanal Sul-mato-grossense

Sequenciamento de DNA Mitocondrial para Avaliação de diferenças genéticas em ovinos (Ovis aries)

O sequenciamento de Sanger, ou identificação das bases moleculares do DNA por terminação da cadeia, é um dosmétodos amplamente utilizados para estudos moleculares. O uso da região citocromo b do DNA mitocondrial comomarcador molecular se justifica pela presença de regiões conservadas e variáveis que podem ser sequenciadas e utilizadas em análises filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do DNAmitocondrial por meio de sequenciamento de Sanger. Para tanto, amostras de tecido sanguíneo de ovinos do grupamentogenético Pantaneiro (n=14), Bergamácia (n=4), Dorper (n=5) e Ile de France (n=5) foram utilizadas para extração deDNA. Logo em seguida as amostras foram submetidas a procedimentos de amplificação, purificação e sequenciamento.As análises estatísticas foram realizadas nos programas BioEdit 7.3.1.0 e MEGA 5.10. A utilização de primers internose externos possibilitou o sequenciamento de 86% da região do citocromo b, o que indicou menor perda de nucleotídeosque acontece na reação de sequenciamento com apenas um par de primers. Os cálculos de diversidade média da regiãosequenciada permitiram observar baixa variação genética na população, evidenciando a natureza conservada do DNAherdado maternalmente. O sequenciamento parcial da região do citocromo b foi capaz de mostrar a variação do DNAmitocondrial em ovinos de 4 raças diferentes e proporcionou gerar dados para a realização de estudos futuros de origeme evolução dos animais.O sequenciamento de Sanger, ou identificação das bases moleculares do DNA por terminação da cadeia, é um dosmétodos amplamente utilizados para estudos moleculares. O uso da região citocromo b do DNA mitocondrial comomarcador molecular se justifica pela presença de regiões conservadas e variáveis que podem ser sequenciadas e utilizadas em análises filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do DNAmitocondrial por meio de sequenciamento de Sanger. Para tanto, amostras de tecido sanguíneo de ovinos do grupamentogenético Pantaneiro (n=14), Bergamácia (n=4), Dorper (n=5) e Ile de France (n=5) foram utilizadas para extração deDNA. Logo em seguida as amostras foram submetidas a procedimentos de amplificação, purificação e sequenciamento.As análises estatísticas foram realizadas nos programas BioEdit 7.3.1.0 e MEGA 5.10. A utilização de primers internose externos possibilitou o sequenciamento de 86% da região do citocromo b, o que indicou menor perda de nucleotídeosque acontece na reação de sequenciamento com apenas um par de primers. Os cálculos de diversidade média da regiãosequenciada permitiram observar baixa variação genética na população, evidenciando a natureza conservada do DNAherdado maternalmente. O sequenciamento parcial da região do citocromo b foi capaz de mostrar a variação do DNAmitocondrial em ovinos de 4 raças diferentes e proporcionou gerar dados para a realização de estudos futuros de origeme evolução dos animais

VARIAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PROTEINASE K EM PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA DE BOVINO

Os procedimentos padrões para extração de DNA incluem o tratamento com proteinase k e posterior incubação em banho-maria por um determinado tempo. Sendo assim, avaliar métodos de extração de DNA que minimizem a quantidade de proteinase k e o tempo necessário para a realização das etapas, em que seja mantida a eficiência no que tange à quantidade, qualidade e a possibilidade de amplificação por PCR do DNA extraído, é de extrema importância para os estudos moleculares baseados em ácidos nucléicos. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de protocolos de extração de DNA, variando-se a concentração de proteinase k e tempo de incubação em banho-maria. O DNA foi extraído a partir de sangue periférico de bovinos. Para a extração do DNA genômico, utilizou-se oito protocolos que diferiam em concentrações de proteinase k (0,04 e 0,08µg mL-1) em intervalos de tempo variados (90, 180, 360 minutos e overnight). O DNA foi analisado quanto à sua qualidade, quantidade e viabilidade de amplificação. Foi possível obter DNA genômico de qualidade, com concentrações e pureza satisfatórias para amplificação. Com base nas análises estatísticas, as variações no protocolo tiveram efeitos isolados, ou seja, a qualidade do DNA foi suscetível à concentração de proteinase k e ao tempo no banho-maria, entretanto a quantidade de DNA das amostras foi suscetível ao tempo de incubação em banho-maria, não tendo interferência pela concentração de proteinase k. Apesar dos efeitos isolados, os parâmetros estudados influenciaram de maneira significativa na qualidade e quantidade de DNA

Avaliação de protocolos para extração de DNA Genômico de sangue Bovino

Basic studies on DNA extraction techniques are very important for the success of scientific papers in the field ofmolecular biology. The extraction and purification of nucleic acids are critical steps for establishing further geneticanalysis. The objective of this study was to evaluate the efficacy of different protocols for DNA extraction by deter- mining the quantity and quality of extracted genetic material and the possibility of amplification by PCR. We didDNA extraction and PCR of ten bovine blood samples. The test results obtained by spectrophotometry indicated thatthe quantity and quality of genomic DNA were considered satisfactory in all protocols for PCR. However, there wasa statistically significant difference between the parameters measured, both in quantity and in quality (p <0.01). Theextraction protocol using whole blood was more efficient in terms of time and quality; there was no degradation inall processes of extraction. It was also demonstrated that the possibility of amplification of the region of exon 2 ofthe leptin gene in extracted DNA exists.Estudos básicos sobre técnicas de extração de DNA são de extrema importância para o sucesso de trabalhos científicos no campo da biologia molecular. A extração e a purificação de ácidos nucleicos constituem etapas fundamentaispara o estabelecimento de posteriores análises genéticas. Objetivou-se neste trabalho avaliar a eficácia de diferentesprotocolos de extração de DNA por meio da determinação de quantidade, qualidade e a possibilidade de amplificação por meio de PCR do material genético extraído. Utilizou-se amostras de sangue de dez animais, que foramsubmetidas à extração de DNA e, logo após à reação em cadeia pela polimerase (PCR). Os resultados das análisesobtidas por nanofotometria indicaram que a quantidade e a qualidade do DNA genômico foram consideradas satisfatórias, em todos os protocolos, para a realização da PCR, mas houve diferença estatística significativa entre osparâmetros analisados, tanto na quantidade quanto na qualidade (p < 0.05) do DNA obtido. O protocolo de extraçãoutilizando sangue total foi mais eficiente quanto ao tempo e a qualidade do DNA extraído, entretanto em todos osprocessos de extração houve ausência de degradação. Também foi demonstrado a possibilidade de amplificação daregião do exon 2 do gene da leptina de bovinos no DNA extraído

Secuencias del gen mitocondrial para identificación de especies de animales

Molecular markers based on mitochondrial DNA (mtDNA) have maternal inheritance and may be used to evaluate phylogenetic and taxonomic issues.The similarity diagnosis of living beings can be performed by genomic analysis of the 16S ribosomal RNA (16S rRNA). The aim of this study was to evaluate the molecular marker in 16S rRNA gene potential to identify different animal species and determine the degree of genetic similarity among individuals. DNA was extracted from 13 animals being 5 sheep, 4 cattle and 4 fish and the samples were amplified, purified and sequenced. The analysis were made with MEGA 5.10 and BLAST programs. The sequences identified on GenBank® showed that the animals belonged to the Ovis aries (sheep), Bos taurus (cattle), Prochilodus lineatus (curimba), Pseudoplatystoma corruscans (pintado), Pseudoplatystoma reticulatum (cachara) and Leporinus obtusidens (piau) species. The genetic distance between the different animal groups was 0,10 cattle/sheep, 0,66 cattle/fish and 0,65 sheep/fish. The construction of the phylogenetic tree has determined two different classes being Mammalia containing the subfamillies: Bovinae and Caprinae, and Actinopterygii containing the orders: Caraciforme (curimba and piau) and Siluriforme (pintado and cachara). The mtDNA molecular markers technology demonstrated the possibility of using it as a tool for species identification and differentiation thereby assisting the work of taxonomists. Thus, the partial sequencing of the 16S rRNA gene was sufficient for the identification of sheep, cattle and different species of fish based on the similarity of that gene in BLAST. Marcadores moleculares basados en el ADN mitocondrial (ADNmt) tienen herencia materna y se pueden utilizar para evaluar relaciones filogenéticas y taxonómicas. El diagnóstico de similaridad en los seres vivos se puede lograr mediante análisis genómico del ARN ribosomal 16S (16S rARN). El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial de marcador molecular en el16S ARNr como una metodología para la identificación de las diferentes especies de animales y determinar el grado de similitud genética entre estos individuos. Para ello, el ADN se extrajo a partir de 13 animales, 5 ovinos, 4 bovinos y 4 peces, a continuación se amplificaron, se purificaron y se secuenciaron las muestras. Los análisis de las secuencias se realizaron en los programas MEGA 5.10 y BLAST. Las secuencias identificadas en GenBank® mostraron que los animales pertenecían a las espécies Ovis aries (ovino), Bos taurus (bovino), Prochilodus lineatus (curimba) Pseudoplatystoma corruscans (pintado), Pseudoplatystoma reticulatum (cachara) y Leporinus obtusidens (piau). La distancia genética entre los diferentes grupos de animales fue de 0,10 bovinos/ovinos, 0,66 bovinos/peces y 0,65 ovinos/peces. La construcción del árbol filogenético ha determinado dos clases distintas siendo Mammalia, que contiene las subfamilias: Bovinae y Caprinae, y Actinopterygii que contiene las órdenes: Caraciforme (curimba y piau) y Siluriforme (pintado y cachara). La tecnología de los marcadores moleculares del ADNmt demonstró la posibilidad de utilizarla como herramienta en la identificación y diferenciación de las especies asistiendo a la obra de los taxonomistas. Por lo tanto, la secuenciación parcial de la región del gen 16S rARN fue suficiente para la identificación de ovinos, bovinos y diferentes especies de peces sobre la base de la similitud del gen en programa BLAST

Uso de biomarcadores para monitoramento das águas do Córrego Arara no município de Rio Brilhante, MS, Brasil

O objetivo deste trabalho foi avaliar a mutagenicidade, genotoxicidade e citotoxicidade de amostras de água provenientes do Córrego Arara no município de Rio Brilhante, MS, Brasil, por meio de testes toxicológicos utilizando biomarcadores. Para avaliar a mutagenicidade utilizou-se o teste de micronúcleo, para a genotoxicidade o ensaio cometa, ambos com Astyanax altiparanae, e para analisar a citotoxicidade utilizou-se o teste de Allium cepa. As coletas foram realizadas nos meses de abril e junho de 2013, em três pontos distintos (pontos 1, 2 e 3) do Córrego Arara e no Tanque de Irrigação da UFGD (ponto 4). Os resultados indicaram aumento significativo na frequência de micronúcleos pisceos na coleta do mês de junho quando comparada com a realizada em abril. No teste de Allium cepa, o efeito citotóxico apresentou-se significativamente maior na coleta de abril, porém a genotoxicidade das águas não apresentou diferença estatística entre os meses de coleta. O maior número de danos no ensaio cometa ocorreu no ponto 4, em ambos períodos de coleta. A análise química da água indicou níveis de cádmio, cromo, cobre, chumbo e níquel, com valores superiores ao permitido pela legislação vigente. A presença de metais acima dos níveis permitidos nas amostras de água analisadas do Córrego Arara indica possíveis potenciais mutagênicos, genotóxicos e citotóxicos aos organismos devido a esses poluentes derivados ou não de ações antrópicas. Assim sendo, este trabalho pode contribuir como ferramenta adicional ao controle da qualidade da água do Córrego Arara, considerando sua utilização e importância para a região