Evolutionary Conserved Regulatory Mechanisms of the JAK/STAT pathway

Väitöskirjassa tutkitaan solujen välisessä viestinnässä tärkeän solun sisäisen JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin säätelymekanismeja. Sytokiinit ovat elimistömme solujen tuottamia liukoisia välittäjäaineita, jotka säätelevät monia biologisia tapahtumia kuten immuunijärjestelmän solujen jakautumista, erilaistumista ja aktiivisuutta. Sytokiinien vaikutukset välittyvät kohdesolujen pinnalla olevien vastaanottimien eli reseptorien kautta. Sytokiinin sitoutuminen reseptoriinsa aikaansaa solun sisäisten JAK-signalointiproteiinien aktivaation. Aktivoidut JAK-proteiinit fosforyloivat STAT-transkriptiotekijöissä tietyn tyrosiini-aminohappotähteen, jonka seurauksena STAT-proteiinit pariutuvat ja siirtyvät solun tumaan, missä ne sitoutuvat niille spesifisten kohdegeenien säätelyalueille vaikuttaen kyseisten geenien luentaan. JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin aktiivisuus on tarkoin säädelty reitin jokaisella tasolla. Säätelyn häiriytyminen ja reitin virheellinen toiminta on yhteydessä moniin sairauksiin, kuten erilaisiin autoimmuunitauteihin ja syöpään. Ymmärtääksemme tarkemmin näiden sairauksien molekyylitason mekanismeja ja kehittääksemme uusia hoitomuotoja näihin sairauksiin, on JAK/STAT-reitin säätelyjärjestelmien yksityiskohtainen tunteminen erittäin tärkeää. JAK/STAT-tiedonsiirtoreitti on säilynyt hyvin muuttumattomana eläinten evoluutiossa ja ihmisen reittiä vastaava tiedonsiirtokaskadi toimii myös banaanikärpäsen (Drosophila melanogaster) soluissa. Geneettisen muunneltavuutensa vuoksi banaanikärpänen on biolääketieteellisessä tutkimuksessa hyvin laajasti hyödynnetty malliorganismi. Väitöskirjatyössä on pyritty selvittämään banaanikärpästä malliorganismina käyttäen uusia JAK/STAT-signalointireitin aktiivisuuteen vaikuttavia molekyylejä. Sumolaatio on yleinen proteiinien translaationjälkeinen muokkaus, jossa kohdeproteiiniin liitetään SUMO-niminen pieni säätelyproteiini. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä osoitettiin, että banaanikärpäsen ainoa STAT-transkriptiotekijä, Stat92E, on säädelty sumolaation välityksellä. SUMO:n löydettiin liittyvän Stat92E-proteiinissa lysiini 187 aminohappotähteeseen. Lisäksi sumolaation osoitettiin vaikuttavan negatiivisesti Stat92E-transkriptiotekijän aktiivisuuteen. Tutkimus osoittaa, että sumolaatio on STAT-transkriptiotekijöiden evolutiivisesti konservoitunut säätelymekanismi, sillä aiemmin myös ihmisen STAT1-transkriptiotekijän on osoitettu olevan säädelty sumolaation välityksellä. Väitöskirjan kaksi muuta osatyötä pohjautuvat banaanikärpäsen S2-solulinjassa tehtyyn RNA-häirintäseulaan, jonka tarkoituksena on ollut löytää uusia JAK/STAT-reitin aktiivisuuteen vaikuttavia geenituotteita. Seulassa löydetyistä geenituotteista kaksi, Eye transformer ja Not4, valittiin tarkempiin jatkotutkimuksiin. ET-proteiinin osoitettiin toimivan banaanikärpäsen JAK/STAT-reitin negatiivisena säätelijänä, vaikuttaen inhiboivasti Stat92E-proteiinin tyrosiinifosforylaatioon. Banaanikärpäsen Not4-proteiinin löydettiin puolestaan vaikuttavan positiivisesti JAK/STAT-reitin säätelemien geenien ilmentymiseen. Lisäksi Not4-proteiinia vastaavan ihmisproteiinin, CNOT4:n, poisto RNA-häirinnällä ihmisen HeLa-solulinjasta alensi STAT1- ja STAT6 -välitteisten kohdegeenien ilmentymistä. Jatkotutkimukset banaanikärpäsen soluissa osoittivat, että Not4 kykenee sitoutumaan Stat92E proteiiniin ja, että Not4 vaaditaan Stat92E-proteiinin sitoutumiseen tietyn TotM-kohdegeeninsä säätelyalueelle. Tässä tutkimuksessa on löydetty banaanikärpäsen Stat92E-transkriptiotekijän olevan negatiivisesti säädelty sumolaation kautta, osoittaen sumolaation olevan evoluutiossa säilynyt JAK/STAT-reitin säätelymekanismi. Lisäksi tutkimuksessa on karakterisoitu kaksi ennestään tuntematonta JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin säätelijämolekyyliä; ET ja Not4/CNOT4. Nämä täysin uudet löydökset luovat hyvän pohjan jatkotutkimuksille immuunijärjestelmän ja sen häiriöiden ymmärtämiseksi.Cytokines are secreted proteins or glycoproteins that are responsible for mediating cell to cell signals and orchestrating numerous biological events including the activation, proliferation and differentation of the cells of the immune system. Cytokine signals are mediated through specific transmembrane receptors on the surface of their target cells. The binding of a hematopoietic cytokine to its receptor triggers the activation of receptor-associated Janus kinases (JAKs). This is followed by the activation of their downstream targets, Signal transducers and activators of transcription (STATs) through tyrosine phosphorylation. Activated STATs dimerize and translocate to the nucleus, where they modulate the transcription of their target genes. The activity of this signaling cascade is under the control of regulatory proteins, such as Protein inhibitors of activated STAT (PIAS), Suppressors of cytokine signaling (SOCS) and various protein tyrosine phosphatases (PTPs). Moreover, JAKs and STATs are regulated by different post-translational modifications, like in the case of STAT1 and STAT5 through the covalent conjugation of a small ubiquitin-like modifier (SUMO). The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution. In the fruit fly, Drosophila melanogaster, the JAK/STAT cascade plays a crucial role in various developmental events as well as in the immune response, and it is activated by a set of secreted mediators called Unpaired (Upd). In this thesis Drosophila melanogaster was used as a model organism to study the regulation of the JAK/STAT pathway. The only known Drosophila STAT transcription factor, Stat92E, was shown to be modified with SUMO at a single lysine, K187. Mutating this SUMO conjugation site increased the Upd-induced transcriptional activity of Stat92E, suggesting that the sumoylation of Stat92E negatively regulates the Drosophila JAK/STAT pathway. This indicates that sumoylation is an evolutionary conserved regulatory mechanism of STAT-mediated signal transduction. RNA interference (RNAi) has been found to function exceptionally well in Drosophila cells, and also in vivo in adult flies. A genome-wide RNAi screen was conducted in Drosophila S2 cells to reveal novel JAK/STAT pathway associated genes. As a result six potential JAK/STAT pathway regulating genes were found, of which two; Eye transformer (ET) and Not4 were studied in more detail. ET encodes a gp130-related transmembrane protein that was found to inhibit Upd-induced Stat92E tyrosine phosphorylation, thus it functions as a negative regulator of the Drosophila JAK/STAT pathway. RNAi of Not4 was found to repress the Drosophila JAK/STAT pathway target gene expression in Drosophila cells, indicating that Not4 is needed for the JAK/STAT pathway to function properly. Furthermore, overexpression of Not4 resulted in enhanced Stat92E-mediated gene responses, confirming Not4 as a positive regulator of the Drosophila JAK/STAT pathway. We found that Not4 is able to interact with Stat92E, but does not affect Stat92E tyrosine phosphorylation. Finally, our experiments indicated that Not4 is needed for Stat92E to properly bind to its target DNA sequence at the promoter of the stress gene TurandotM (TotM). The Not4 mammalian homologue CNOT4 was also shown to participate in STAT1- and STAT6-mediated gene expression in human cells, indicating that Not4/CNOT4 is an evolutionary conserved regulator of JAK/STAT signaling

Immuunivajeiden mekanismit - uuden äärellä

Vertaisarvioitu.Synnynnäiset immuunivajeet ovat useimmiten yhden geenivirheen aiheuttamia immuunijärjestelmän säätelyhäiriöitä, ja vasta osan kohdegeeni tunnetaan. Uusia immuunivajeita aiheuttavien geenimutaatioiden tunnistaminen on helpottunut, kun eksomi- ja genominsekvensointimenetelmät ovat kehittyneet ja kustannukset pienentyneet. Edelleen tarvitaan pitkäjänteistä perustutkimustyötä mutaation aiheuttamien molekyylitason mekanismien ja tautiyhteyden selvittämiseksi. Eri mutaatiot samassa geenissä voivat aiheuttaa hyvin erilaisia ilmiasuja. Kahdenkymmenen vuoden aikana on löydetty lähes 380 uutta immuunivajetta ja lukuisia uusia ilmiasuja. Useat näistä aiheutuvat geenien transkriptiota säätelevien transkriptiotekijöiden muutoksista. NFKB1-geenin vallitsevasti periytyvät mutaatiot voivat aiheuttaa vasta-ainepuutoksen, autoimmuunisairauden tai inflammasomivälitteisen autoinflammaation. BACH2-geenin mutaatiot aiheuttavat immuunipuutos- ja autoimmuunisairauden häiritsemällä lymfosyyttien erilaistumista. CEBPE p.R219H-mutaatio saa aikaan uusien C/EBPε-kohdegeenien ilmentymisen ja "nonkanonisen" CASP4/5-inflammasomin yliaktiivisuuden.Peer reviewe

Effects of White Matter Hyperintensities on Verbal Fluency in Healthy Older Adults and MCI/AD

Background: White matter hyperintensities (WMHs) are markers for cerebrovascular pathology, which are frequently seen in patients with mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease (AD). Verbal fluency is often impaired especially in AD, but little research has been conducted concerning the specific effects of WMH on verbal fluency in MCI and AD.Objective: Our aim was to examine the relationship between WMH and verbal fluency in healthy old age and pathological aging (MCI/AD) using quantified MRI data.Methods: Measures for semantic and phonemic fluency as well as quantified MRI imaging data from a sample of 42 cognitively healthy older adults and 44 patients with MCI/AD (total n = 86) were utilized. Analyses were performed both using the total sample that contained seven left-handed/ambidextrous participants, as well with a sample containing only right-handed participants (n = 79) in order to guard against possible confounding effects regarding language lateralization.Results: After controlling for age and education and adjusting for multiple correction, WMH in the bilateral frontal and parieto-occipital areas as well as the right temporal area were associated with semantic fluency in cognitively healthy and MCI/AD patients but only in the models containing solely right-handed participants.Conclusion: The results indicate that white matter pathology in both frontal and parieto-occipital cerebral areas may have associations with impaired semantic fluency in right-handed older adults. However, elevated levels of WMH do not seem to be associated with cumulative effects on verbal fluency impairment in patients with MCI or AD. Further studies on the subject are needed.</div

Structure-function analysis indicates that sumoylation modulates DNA-binding activity of STAT1

Background STAT1 is an essential transcription factor for interferon-γ-mediated gene responses. A distinct sumoylation consensus site (ψKxE) 702IKTE705 is localized in the C-terminal region of STAT1, where Lys703 is a target for PIAS-induced SUMO modification. Several studies indicate that sumoylation has an inhibitory role on STAT1-mediated gene expression but the molecular mechanisms are not fully understood. Results Here, we have performed a structural and functional analysis of sumoylation in STAT1. We show that deconjugation of SUMO by SENP1 enhances the transcriptional activity of STAT1, confirming a negative regulatory effect of sumoylation on STAT1 activity. Inspection of molecular model indicated that consensus site is well exposed to SUMO-conjugation in STAT1 homodimer and that the conjugated SUMO moiety is directed towards DNA, thus able to form a sterical hindrance affecting promoter binding of dimeric STAT1. In addition, oligoprecipitation experiments indicated that sumoylation deficient STAT1 E705Q mutant has higher DNA-binding activity on STAT1 responsive gene promoters than wild-type STAT1. Furthermore, sumoylation deficient STAT1 E705Q mutant displayed enhanced histone H4 acetylation on interferon-γ-responsive promoter compared to wild-type STAT1. Conclusions Our results suggest that sumoylation participates in regulation of STAT1 responses by modulating DNA-binding properties of STAT1. Keywords: Signal transduction; Transcription factors; Sumoylation; Signal transducers and activators of transcription (STATs); InterferonBioMed Central open acces

Characterization of Expanded Gamma Delta T Cells from Atypical X-SCID Patient Reveals Preserved Function and IL2RG-Mediated Signaling

Abnormally high gamma delta T cell numbers among individuals with atypical SCID have been reported but detailed immunopheno typing and functional characterization of these expanded gamma delta T cells are limited. We have previously reported atypical SCID phenotype caused by hypomorphic IL2RG (NM_000206.3) c.172C > T;p.(Pro58Ser) variant. Here, we have further investigated the index patient's abnormally large gamma delta T cell population in terms of function and phenotype by studying IL2RG cell surface expression, STAT tyrosine phosphorylation and blast formation in response to interleukin stimulation, immunophenotyping, TCRv gamma sequencing, and target cell killing. In contrast to his alpha beta T cells, the patient's gamma delta T cells showed normal IL2RG cell surface expression and normal or enhanced IL2RG-mediated signaling. V delta 2 + population was proportionally increased with a preponderance of memory phenotypes and high overall tendency towards perforin expression. The patient's gamma delta T cells showed enhanced cytotoxicity towards A549 cancer cells. His TCRv gamma repertoire was versatile but sequencing of IL2RG revealed a novel c.534C > A; p.(Phe178Leu) somatic missense variant restricted to gamma delta T cells. Over time this variant became predominant in gamma delta T cells, though initially present only in part of them. IL2RG-Pro58Ser/Phe178Leu variant showed higher cell surface expression compared to IL2RG-Pro58Ser variant in stable HEK293 cell lines, suggesting that somatic p.(Phe178Leu) variant may at least partially rescue the pathogenic effect of germline p.(Pro58Ser) variant. In conclusion, our report indicates that expansion of gamma delta T cells associated with atypical SCID needs further studying and cannot exclusively be deemed as a homeostatic response to low numbers of conventional T cells.Peer reviewe

Novel Hemizygous IL2RG p.(Pro58Ser) Mutation Impairs IL-2 Receptor Complex Expression on Lymphocytes Causing X-Linked Combined Immunodeficiency

Hypomorphic IL2RG mutations may lead to milder phenotypes than X-SCID, named variably as atypical X-SCID or X-CID. We report an 11-year-old boy with a novel c. 172C>T;p.(Pro58Ser) mutation in IL2RG, presenting with atypical X-SCID phenotype. We also review the growing number of hypomorphic IL2RG mutations causing atypical X-SCID. We studied the patient's clinical phenotype, B, T, NK, and dendritic cell phenotypes, IL2RG and CD25 cell surface expression, and IL-2 target gene expression, STAT tyrosine phosphorylation, PBMC proliferation, and blast formation in response to IL-2 stimulation, as well as protein-protein interactions of the mutated IL2RG by BioID proximity labeling. The patient suffered from recurrent upper and lower respiratory tract infections, bronchiectasis, and reactive arthritis. His total lymphocyte counts have remained normal despite skewed T and B cells subpopulations, with very low numbers of plasmacytoid dendritic cells. Surface expression of IL2RG was reduced on his lymphocytes. This led to impaired STAT tyrosine phosphorylation in response to IL-2 and IL-21, reduced expression of IL-2 target genes in patient CD4+ T cells, and reduced cell proliferation in response to IL-2 stimulation. BioID proximity labeling showed aberrant interactions between mutated IL2RG and ER/Golgi proteins causing mislocalization of the mutated IL2RG to the ER/Golgi interface. In conclusion, IL2RG p.(Pro58Ser) causes X-CID. Failure of IL2RG plasma membrane targeting may lead to atypical X-SCID. We further identified another carrier of this mutation from newborn SCID screening, lost to closer scrutiny.Peer reviewe

BACH2 immunodeficiency illustrates an association between super-enhancers and haploinsufficiency.

The transcriptional programs that guide lymphocyte differentiation depend on the precise expression and timing of transcription factors (TFs). The TF BACH2 is essential for T and B lymphocytes and is associated with an archetypal super-enhancer (SE). Single-nucleotide variants in the BACH2 locus are associated with several autoimmune diseases, but BACH2 mutations that cause Mendelian monogenic primary immunodeficiency have not previously been identified. Here we describe a syndrome of BACH2-related immunodeficiency and autoimmunity (BRIDA) that results from BACH2 haploinsufficiency. Affected subjects had lymphocyte-maturation defects that caused immunoglobulin deficiency and intestinal inflammation. The mutations disrupted protein stability by interfering with homodimerization or by causing aggregation. We observed analogous lymphocyte defects in Bach2-heterozygous mice. More generally, we observed that genes that cause monogenic haploinsufficient diseases were substantially enriched for TFs and SE architecture. These findings reveal a previously unrecognized feature of SE architecture in Mendelian diseases of immunity: heterozygous mutations in SE-regulated genes identified by whole-exome/genome sequencing may have greater significance than previously recognized

Evolutionary Conserved Regulatory Mechanisms of the JAK/STAT pathway

Väitöskirjassa tutkitaan solujen välisessä viestinnässä tärkeän solun sisäisen JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin säätelymekanismeja. Sytokiinit ovat elimistömme solujen tuottamia liukoisia välittäjäaineita, jotka säätelevät monia biologisia tapahtumia kuten immuunijärjestelmän solujen jakautumista, erilaistumista ja aktiivisuutta. Sytokiinien vaikutukset välittyvät kohdesolujen pinnalla olevien vastaanottimien eli reseptorien kautta. Sytokiinin sitoutuminen reseptoriinsa aikaansaa solun sisäisten JAK-signalointiproteiinien aktivaation. Aktivoidut JAK-proteiinit fosforyloivat STAT-transkriptiotekijöissä tietyn tyrosiini-aminohappotähteen, jonka seurauksena STAT-proteiinit pariutuvat ja siirtyvät solun tumaan, missä ne sitoutuvat niille spesifisten kohdegeenien säätelyalueille vaikuttaen kyseisten geenien luentaan. JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin aktiivisuus on tarkoin säädelty reitin jokaisella tasolla. Säätelyn häiriytyminen ja reitin virheellinen toiminta on yhteydessä moniin sairauksiin, kuten erilaisiin autoimmuunitauteihin ja syöpään. Ymmärtääksemme tarkemmin näiden sairauksien molekyylitason mekanismeja ja kehittääksemme uusia hoitomuotoja näihin sairauksiin, on JAK/STAT-reitin säätelyjärjestelmien yksityiskohtainen tunteminen erittäin tärkeää. JAK/STAT-tiedonsiirtoreitti on säilynyt hyvin muuttumattomana eläinten evoluutiossa ja ihmisen reittiä vastaava tiedonsiirtokaskadi toimii myös banaanikärpäsen (Drosophila melanogaster) soluissa. Geneettisen muunneltavuutensa vuoksi banaanikärpänen on biolääketieteellisessä tutkimuksessa hyvin laajasti hyödynnetty malliorganismi. Väitöskirjatyössä on pyritty selvittämään banaanikärpästä malliorganismina käyttäen uusia JAK/STAT-signalointireitin aktiivisuuteen vaikuttavia molekyylejä. Sumolaatio on yleinen proteiinien translaationjälkeinen muokkaus, jossa kohdeproteiiniin liitetään SUMO-niminen pieni säätelyproteiini. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä osoitettiin, että banaanikärpäsen ainoa STAT-transkriptiotekijä, Stat92E, on säädelty sumolaation välityksellä. SUMO:n löydettiin liittyvän Stat92E-proteiinissa lysiini 187 aminohappotähteeseen. Lisäksi sumolaation osoitettiin vaikuttavan negatiivisesti Stat92E-transkriptiotekijän aktiivisuuteen. Tutkimus osoittaa, että sumolaatio on STAT-transkriptiotekijöiden evolutiivisesti konservoitunut säätelymekanismi, sillä aiemmin myös ihmisen STAT1-transkriptiotekijän on osoitettu olevan säädelty sumolaation välityksellä. Väitöskirjan kaksi muuta osatyötä pohjautuvat banaanikärpäsen S2-solulinjassa tehtyyn RNA-häirintäseulaan, jonka tarkoituksena on ollut löytää uusia JAK/STAT-reitin aktiivisuuteen vaikuttavia geenituotteita. Seulassa löydetyistä geenituotteista kaksi, Eye transformer ja Not4, valittiin tarkempiin jatkotutkimuksiin. ET-proteiinin osoitettiin toimivan banaanikärpäsen JAK/STAT-reitin negatiivisena säätelijänä, vaikuttaen inhiboivasti Stat92E-proteiinin tyrosiinifosforylaatioon. Banaanikärpäsen Not4-proteiinin löydettiin puolestaan vaikuttavan positiivisesti JAK/STAT-reitin säätelemien geenien ilmentymiseen. Lisäksi Not4-proteiinia vastaavan ihmisproteiinin, CNOT4:n, poisto RNA-häirinnällä ihmisen HeLa-solulinjasta alensi STAT1- ja STAT6 -välitteisten kohdegeenien ilmentymistä. Jatkotutkimukset banaanikärpäsen soluissa osoittivat, että Not4 kykenee sitoutumaan Stat92E proteiiniin ja, että Not4 vaaditaan Stat92E-proteiinin sitoutumiseen tietyn TotM-kohdegeeninsä säätelyalueelle. Tässä tutkimuksessa on löydetty banaanikärpäsen Stat92E-transkriptiotekijän olevan negatiivisesti säädelty sumolaation kautta, osoittaen sumolaation olevan evoluutiossa säilynyt JAK/STAT-reitin säätelymekanismi. Lisäksi tutkimuksessa on karakterisoitu kaksi ennestään tuntematonta JAK/STAT-tiedonsiirtoreitin säätelijämolekyyliä; ET ja Not4/CNOT4. Nämä täysin uudet löydökset luovat hyvän pohjan jatkotutkimuksille immuunijärjestelmän ja sen häiriöiden ymmärtämiseksi.Cytokines are secreted proteins or glycoproteins that are responsible for mediating cell to cell signals and orchestrating numerous biological events including the activation, proliferation and differentation of the cells of the immune system. Cytokine signals are mediated through specific transmembrane receptors on the surface of their target cells. The binding of a hematopoietic cytokine to its receptor triggers the activation of receptor-associated Janus kinases (JAKs). This is followed by the activation of their downstream targets, Signal transducers and activators of transcription (STATs) through tyrosine phosphorylation. Activated STATs dimerize and translocate to the nucleus, where they modulate the transcription of their target genes. The activity of this signaling cascade is under the control of regulatory proteins, such as Protein inhibitors of activated STAT (PIAS), Suppressors of cytokine signaling (SOCS) and various protein tyrosine phosphatases (PTPs). Moreover, JAKs and STATs are regulated by different post-translational modifications, like in the case of STAT1 and STAT5 through the covalent conjugation of a small ubiquitin-like modifier (SUMO). The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution. In the fruit fly, Drosophila melanogaster, the JAK/STAT cascade plays a crucial role in various developmental events as well as in the immune response, and it is activated by a set of secreted mediators called Unpaired (Upd). In this thesis Drosophila melanogaster was used as a model organism to study the regulation of the JAK/STAT pathway. The only known Drosophila STAT transcription factor, Stat92E, was shown to be modified with SUMO at a single lysine, K187. Mutating this SUMO conjugation site increased the Upd-induced transcriptional activity of Stat92E, suggesting that the sumoylation of Stat92E negatively regulates the Drosophila JAK/STAT pathway. This indicates that sumoylation is an evolutionary conserved regulatory mechanism of STAT-mediated signal transduction. RNA interference (RNAi) has been found to function exceptionally well in Drosophila cells, and also in vivo in adult flies. A genome-wide RNAi screen was conducted in Drosophila S2 cells to reveal novel JAK/STAT pathway associated genes. As a result six potential JAK/STAT pathway regulating genes were found, of which two; Eye transformer (ET) and Not4 were studied in more detail. ET encodes a gp130-related transmembrane protein that was found to inhibit Upd-induced Stat92E tyrosine phosphorylation, thus it functions as a negative regulator of the Drosophila JAK/STAT pathway. RNAi of Not4 was found to repress the Drosophila JAK/STAT pathway target gene expression in Drosophila cells, indicating that Not4 is needed for the JAK/STAT pathway to function properly. Furthermore, overexpression of Not4 resulted in enhanced Stat92E-mediated gene responses, confirming Not4 as a positive regulator of the Drosophila JAK/STAT pathway. We found that Not4 is able to interact with Stat92E, but does not affect Stat92E tyrosine phosphorylation. Finally, our experiments indicated that Not4 is needed for Stat92E to properly bind to its target DNA sequence at the promoter of the stress gene TurandotM (TotM). The Not4 mammalian homologue CNOT4 was also shown to participate in STAT1- and STAT6-mediated gene expression in human cells, indicating that Not4/CNOT4 is an evolutionary conserved regulator of JAK/STAT signaling