Mining of new insecticidal protein genes plus determination of the insecticidal spectrum and mode of action of Bacillus thuringiensis Vip3Ca protein

Bacillus thuringiensis és un bacteri que pertany al grup de Bacillus cereus i produeix una gran varietat de proteïnes insecticides juntament amb altres factors de virulència que contribueixen a la seva patogenicitat. Bacillus thuringiensis s'ha considerat com el agent bioinsecticida amb més èxit durant el segle passat. Actualment, és àmpliament utilitzat com agent microbià per a les principals plagues d'insectes com a formulat (selecció de aïllats de B. thuringiensis escollits per la seua combinació de proteïnes insecticides present en el cristall parasporal) o mitjançant l’expressió de les proteïnes insecticides (cultius Bt) en plantes d’interès agronòmic (dacsa, cotó, soja, etc.). En quant al seu cicle de vida, B. thuringiensis és un bacteri gram-positiu, anaeròbic facultatiu, quimioorganotròfic i amb una distribució cosmopolita. El tret característic de B. thuringiensis es la formació de inclusions cristal·lines (proteïnes Cry) que son tòxiques contra insectes, especialment contra plagues que produeixen grans danys en diversos cultius. El mecanisme general de toxicitat de B. thuringiensis consisteix en un primer pas en la ingesta de les proteïnes insecticides i solubilització al tracte intestinal. Després de la solubilització, les proteïnes (protoxines) son activades per les proteases intestinals a la seua forma activa (toxines). Les toxines travessen la membrana peritrófica, s’uneixen als receptors específics de la vora en raspall en la membrana apical del intestí d’insectes susceptibles. Seguit de la unió de la proteïna al receptors específics, aquesta s’insereix, de manera immediata e irreversible, en la membrana cel·lular formant porus que provoquen la lisis cel·lular. La lisis massiva de moltes cèl·lules del intestí provoca la disrupció del intestí i la mort del insecte per septicèmia. A mes a més, B. thuringiensis també produeix altres factors de virulència que faciliten l’acció de les proteïnes insecticides com son: proteases (destrueixen el pèptids antimicrobians generats per part del insecte com a resposta a la intoxicació amb B. thuringiensis), bacteriocines i pèptids antibacterians (competeixen amb la microbiota resident al intestí del insecte), quitinases i “enhancins” (desintegren la membrana peritrófica). En la present tesi doctoral, s’ha realitzat la detecció de nous gens de proteïnes insecticides de B. thuringiensis a partir d'un conjunt d’aïllats de B. thuringiensis seleccionats basat en el seu contingut genètic. També vam estudiar detalladament diferents aspectes (espectre insecticida, resistència creuada, mode d'acció i resposta de mort cel·lular de Spodoptera exigua intoxicada amb la proteïna Vip3Ca) de la nova família de proteïnes Vip3Ca. La recerca de nous gens de proteïnes insecticides amb un espectre insecticida i mode d’acció diferent al descrit per a les diferents toxines B. thuringiensis es una aproximació utilitzada per incrementar l’espectre insecticida de les toxines de B. thuringiensis i retardar l’aparició de poblacions d’insectes resistents. Un mètode utilitzat per a la recerca de nous gens de proteïnes insecticides es el cribat de col·leccions de aïllats de B. thuringiensis de diferents localitzacions i hàbitats mitjançant la utilització de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) o, recentment, mitjançant tecnologies d’alt rendiment com son: la seqüenciació massiva de DNA genòmic de bacteris i la identificació de proteïnes mitjançant de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de masses. Pel que fa a la recerca de nous gens de proteïnes insecticides, vam partir d'un conjunt d’aïllats de B. thuringiensis possibles portadors de nous gens vip1 i vip2. En un primer pas, vàrem realitzar dues PCR on, en la primera d’aquestes, determinàvem la presència de gens vip1 i vip2, mentre que, en la segona PCR, caracteritzàvem a quin del gens vip1 i vip2 descrits eren més semblants les seqüencies obtingudes. Com a resultat obtinguérem la presència de dos nous al·lels de les parelles de gens vip2Ac1 - vip1Ca1 i vip2Bb1 - vip1Bb1 als aïllats B. thuringiensis V-J20.2, V-LE1.1, V-V54.26, V-V54.31, E-TE7.43, E-TE16.5 i E-TE18.40. També es detectaren la presència de dos seqüencies amb baix percentatge d’identitat als gens vip1Bb1 i vip1Da1 als aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2. En un segon pas, per tal de determinar la seqüencia completa dels gens amb baix percentatge d’identitat a vip1Bb1 i vip1Da, es va realitzar la seqüenciació massiva de DNA genòmic de ambdós bacteris mitjançant la plataforma de seqüenciació Illumina HiSeq-PE150. A partir de les lectures netes, subministrades per Novogene S.L., varen ser ensamblades, anotades, i les seqüències codificants foren predites abans de realitzar una recerca per homologia contra una base de dades específica de toxines de B. thuringiensis, i posteriorment es va validar el resultat obtingut amb la recerca per homologia contra la base de dades “Non-Redundant database” del NCBI. Com a resultat obtinguérem la predicció de 24 gens de proteïnes insecticides entre els aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2. Per tal de determinar quants dels gens insecticides predits son expressats pels aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2, es va buscar la seua presència al sobrenedant i en la mescla d’espores i cristalls per medi de la identificació de proteïnes amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses. Com a resultat, trobàrem una nova parella de proteïnes tipus Vip (Vip2Ac-like_1-Vip4Aa-like_1), dues noves proteïnes tipus Vip (Vip2Ac-like_1 i Vip4Aa-like_2), una proteïna semblant a Sip1A (Sip1A-like_1) i vuit proteïnes tipus Cry (Cry23Aa-like, Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Da-like, Cry32Eb-like i Cry73Aa-like). Una vegada determinada el nombre de noves proteïnes insecticides que són produïdes pels aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2, es va procedir a determinar la seua localització subcel·lular i en quina quantitat eren produïdes per B. thuringiensis. Per tal de determinar la localització subcel·lular de les proteïnes tipus Vip i Cry es van detectar les proteïnes presents en el sobrenedant (24h i 48h) i en la mescla d’espores i cristalls per separat, en tres rèpliques independents. El resultat obtingut fou que les proteïnes tipus Vip es van detectar en els sobrenedants, mentre que les proteïnes tipus Cry es van trobar en el cristall parasporal, excepte per la proteïna Cry23Aa-like que també es troba en el sobrenedant del aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 al temps 24 h i 48 h. Pel que respecta a la quantificació de les proteïnes tipus Vip i Cry en tres rèpliques independents, es van utilitzar dues aproximacions diferents: (I) Determinar l’abundància relativa de les proteïnes tipus Vip i Cry en la mateixa rèplica a un temps fixe, i (II) anàlisi lliure de marca dels sobrenedants a 24 h i 48 h dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 per comparar la quantitat de les proteïnes a dos temps concrets. Pel que fa als resultats obtinguts de la abundància relativa, indiquen que les proteïnes tipus Vip s’expressen de manera marginal al sobrenedant a 24 h i 48 h en els aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2. A més a més, en el cas de l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2, la proteïna Cry23Aa-like fou la proteïna més abundant del sobrenedant a 24 h i 48 h, indicant que el cultiu es trobaria en l’inici de la fase d’esporulació. Per a les proteïnes Cry, es van detectar en la mescla d’espores i cristalls, on l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 expressa únicament la proteïna Cry23Aa-like, amb un percentatge en pes entre el 2.5% - 30%, mentre que l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2 expressa set proteïnes diferents amb els següents percentatges en pes: 1.4% - 2.8% Cry45Aa-like_1, 2.0% - 3.3% Cry45Aa-like_1, 1.8% - 5.3% Cry45Aa-like_3, 24.3% - 25.9% Cry32Ea-like, 4.6% - 6.1% Cry32Da-like, 4.4% - 6.2% Cry32Eb-like i 2.8% - 4.2% Cry73Aa-like. En quant als resultats obtinguts de l’anàlisi lliure de marca dels sobrenedants dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 a 24 h i 48 h, indiquen que les proteïnes insecticides Vip4Aa-like_1 i Vip4Aa-like_2 de l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2 mostren diferències significatives entre les 24 h i 48 h. La proteïna Vip4Aa-like_1 es troba incrementada en la seua quantitat dues vegades a 48 h respecte a les 24 h, mentre que la proteïna Vip4Aa-like_2 es va detectar a 24 h però no es detecta a 48 h. Pel que respecta a la resta de proteïnes tipus Vip, es varen trobar al sobrenedant i no mostraren diferències significatives en la seua producció entre les 24 h i 48 h. Per finalitzar aquest estudi, es va comprovar la toxicitat de les proteïnes tipus Vip i Cry expressades pels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 and O-V84.2, mitjançant la realització de bioassajos amb neonats de les espècies d’insectes plaga Spodoptera exigua i Spodoptera littoralis utilitzant el sobrenedant concentrat dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 and O-V84.2 (autoclavats i no autoclavats) i les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls. El resultat dels bioassajos amb les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls de l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 indica que la proteïna Cry23Aa-like mostra certa toxicitat a S. exigua i S. littoralis, mentre que no s’observa cap efecte en les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls de l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2. En quant a les proteïnes tipus Vip, el sobrenedant concentrat, autoclavat i no autoclavat, dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 no mostraren toxicitat front a cap de les dues espècies d’ insectes provades. Les proteïnes Vip3 son proteïnes insecticides produïdes per B. thuringiensis durant la fase vegetativa i secretades al medi extracel·lular. En el moment d’escriptura d’aquesta tesi, les proteïnes Vip3 es troben agrupades en tres famílies proteiques: Vip3A, Vip3B i Vip3C. Les proteïnes Vip3A son les més abundants i, per tant, amb les que s’ha dut a terme la majoria dels estudis publicats i sobre les que més informació es troba disponible sobre el seu espectre insecticida i mode de acció. Pel que respecta a les proteïnes Vip3B i Vip3C, són menys abundants i pocs estudis s’han realitzat amb aquestes proteïnes. La proteïna Vip3A té una mida al voltant de ~85-90 kDa quant és secretada al medi, mentre que al ser activada per les proteases intestinals genera dos fragments, un de 20 kDa (N-terminal) i l’altre de 60 kDa (C-terminal). La toxina activada mostra toxicitat contra un ampli rang d’espècies de lepidòpters, amb alguns d’aquests que fins i tot mostren una baixa susceptibilitat a les proteïnes Cry, com ara pot ser Agrotis ipsilon, S. exigua i Spodoptera frugiperda. Pel que respecta al mode d’acció de les proteïnes Vip3, principalment Vip3Aa, aquest segueix la mateixa seqüencia d’esdeveniments descrits per a les proteïnes Cry: (I) Ingesta de les proteïnes Vip3A per l’insecte, (II) activació de la proteïna Vip3A per part de les proteases intestinals i migració a través de la membrana peritròfica, (III) unió de la proteïna Vip3A activada al receptors específics de membrana de la vora en raspall de les cèl·lules intestinals, i (IV) formació del porus i lisi cel·lular. Pel que respecta a la informació disponible sobre la Vip3Ca, prèvia a la realització de la present tesi doctoral, fou un treball conjunt del grup d’investigació “Control Biotecnològic de Plagues”, de la Universitat de València, i el grup d’investigació “Protección de Cultivos”, de la “Universidad Pública de Navarra”. En aquest treball, publicat en una nota curta, es descriu per primera vegada la proteïna Vip3Ca i demostren que és moderadament tòxica contra Mamestra brassicae, Trichoplusi ni i Crysodeixis chalcites. Donat que ja teníem informació prèvia sobre l’espectre insecticida de la proteïna Vip3Ca, en un primer pas vam ampliar l’estudi sobre el seu espectre insecticida en deu espècies més de lepidòpters plaga (Cydia pomonella, Grapholita molesta, Sesamia nonagrioides, Galleria mellonella, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Ephestia kuehniella, Plodia interpunctella i Ostrinia furnacalis), una espècie d’àfid (Nezara viridula) i un organisme model (Drosophila melanogaster). Es van utilitzar diverses metodologies de bioassaig. Per a les espècies que es va provar la proteïna per contaminació superficial, C. pomonella va ser la més susceptible, seguida de G. mellonella, amb percentatges de mortalitat superiors al 50%. Pel que fa a les quatre espècies on la proteïna es va provar incorporada en la dieta, O. furnacalis va ser la més susceptible, amb un valor LC50 de 0.31 μg/g. Pel que respecta a la resta dels bioassaigs, Tuta absoluta va mostrar certa susceptibilitat a altes concentracions de Vip3Ca (30% de mortalitat). En un segon pas, avaluàrem la proteïna Vip3Ca en colònies d’insectes resistents a les proteïnes Cry1A, Cry2A iVip3. Pel que respecta a la proteïna Vip3A, es troba descrit que les colònies d’insectes resistents a les proteïnes Cry1A o Cry2A no mostren resistència creuada a la Vip3A i vice versa. Per tal de dur a terme aquest objectiu, es varen provar diferents colònies d'insectes resistents a les proteïnes Cry1A (H. armigera, T. ni, O. furnacalis i P. interpunctella), Cry2A (H. armigera i T. ni) i Vip3 i Vip3/Cry2Ab (H. armigera) per a la seua susceptibilitat front a la proteïna Vip3Ca, per determinar si presentaven resistència creuada. Els resultats van mostrar que les colònies d'insectes resistents a Cry1A (H. armigera, T. ni, O. furnacalis i P. interpunctella) o Cry2Ab (H. armigera i T. ni) no mostraren resistència creuada a les proteïnes Vip3 (Vip3Aa i Vip3Ca). Per contra, les colònies de H. armigera resistents a les proteïnes Vip3Aa o Vip3Aa/Cry2Ab van mostrar resistència creuada a la proteïna Vip3Ca. Hem de mencionar que, com un treball secundari sorgit a partir de la recerca d’espècies susceptibles, fou l’estudi monogràfic sobre la susceptibilitat de G. molesta als formulats de B. thuringiensis, les seues toxines i sinergies entre les proteïnes Cry i Vip3. Com a resultat obtinguérem que G. molesta és altament susceptible al formulats de B. thuringiensis, Dipel® i Xentari®, i a les toxines de B. thuringiensis Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C, Vip3Aa i Vip3Af. Una vegada determinat que G. molesta és susceptible a les toxines Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C i Vip3Aa, es va determinar les possibles sinergies entre aquestes proteïnes. Les combinacions de proteïnes Cry1Aa-Vip3Aa i Cry1C-Vip3Aa foren antagòniques mentre que la combinació de proteïnes Cry1Ac-Vip3Aa va mostrar un efecte additiu. És interesant mencionar que el antagonisme detectat en les combinacions de proteïnes Cry1Aa-Vip3Aa i Cry1C-Vip3Aa augmentava segons era major la quantitat de proteïna Vip3A en la mescla; aquest fet suggereix que encara que aquestes no competeixen llocs d’unió potser interactuen en esdeveniments anteriors a la unió fent més o menys accessible la unió al receptor. Per aprofundir en el mode d'acció de la proteïna Vip3Ca i comprovar si és similar al descrit per a la proteïna Vip3A, escollirem M. brassicae degut a la seua relativament alta susceptibilitat a la proteïna Vip3C i Vip3A. Els experiments duts a terme per estudiar el mode d’acció de la proteïna Vip3Ca foren els següents: (I) Proteòlisi i oligomerització de la proteïna Vip3Ca, (II) efectes histopatològics i unió in vivo / in vitro de Vip3Ca, i (III) resposta de la mort cel·lular de S. exigua intoxicada amb Vip3Ca2. (I) Proteòlisi i oligomerització de la proteïna Vip3Ca. En un primer pas volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca mostrava un patró d’activació similar a la proteïna Vip3Aa. S’ha descrit que, per a la proteïna Vip3A, l’activació amb proteases (tripsina o suc intestinal) genera dos fragments de 20 kDa i 60 kDa. Pel que respecta a la proteïna Vip3Ca, primer es va determinar el seu patró proteolític amb tripsina i suc intestinal, mostrant que la proteïna Vip3Ca es processava a dos fragments majoritaris de ~ 70 kDa i ~ 20 kDa, tant si utilitzàvem tripsina com suc intestinal. Hem de fer notar que pel que respecta a la cinètica d’activació de la proteïna Vip3Ca amb el suc intestinal d'espècies d'insectes que mostren diferent susceptibilitat, es correlacionava amb la susceptibilitat d’aquestes espècies d'insectes a la proteïna Vip3Ca. Donat que la cinètica d’activació de la proteïna Vip3Ca amb el suc intestinal de diferents espècies d'insectes es correlaciona amb la susceptibilitat d’aquestes per a la Vip3Ca, volguérem determinar si això es devia a una incorrecta activació de la proteïna. En el cas de la Vip3Aa s’ha demostrat que la diferent susceptibilitat mostrada per part de les diferents espècies d’insectes no es deu a una inapropiada activació de la proteïna. En quant a la proteïna Vip3Ca, per descartar que les diferències en la toxicitat de la proteïna Vip3Ca es devien a una activació inapropiada de la proteïna, la proteïna Vip3Ca es va processar amb suc intestinal de O. nubilalis o M. Brassicae i això no va modificar significativament la seva toxicitat a cap espècie d'insecte. Per finalitzar aquest punt volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca forma oligòmers (tetràmers) com ja s’ha demostrar per a la proteïna Vip3Aa. Per determinar si la proteïna Vip3Ca forma oligòmers, la mida de la Vip3Ca digerida amb tripsina i suc intestinal de M. brassicae es va determinar per cromatografia d’exclusió molecular. Com a resultat, vam trobar que la proteïna Vip3Ca activada, tant amb tripsina com amb suc intestinal, forma un oligòmer de 4 unitats que és estable fins a dos dies en solució. A més, els fragments de la toxina de ~ 70 kDa i ~ 20 kDa elueixen junts, el que suggereix que ambdós fragments de proteïnes són necessaris per formar l'oligòmer, com ja s’ha demostrat per a la proteïna Vip3Aa. (II) Efectes histopatològics i unió in vivo / in vitro de Vip3Ca. En un primer pas volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca és capaç de causar danys en l’intestí d’espècies d’insectes susceptibles i si s’uneix la proteïna de manera específica a receptors de membrana i competeix pels mateixos llocs d’unió que la Vip3Aa. Els efectes histopatològics de la proteïna Vip3Ca es van determinar en talls histològics de l’intestí de M .brassicae intoxicat a diferents temps amb la proteïna Vip3Ca. Els resultats van indicar que la proteïna Vip3Ca pot causar grans danys en l'epiteli intestinal de M. brassicae, però quan es va comparar amb la Vip3Aa (control positiu de toxicitat), es va veure que la proteïna Vip3Ca necessita més temps per a mostrar els mateixos efectes histopatològics que la proteïna Vip3Aa. Per determinar si els danys observat a l’epiteli intestinal de M. brassicae es devien a la unió de la proteïna Vip3Ca a les cèl·lules de l’epiteli intestinal, les larves de M .brassicae es van alimentar amb Vip3Ca durant 3 h. El resultat va ser que la Vip3Ca s’unia a l’epiteli de M. brassicae, observat mitjançant tècniques immunofluorecents. Amb l'objectiu de demostrar que la unió observada de la proteïna Vip3Ca a l’epiteli intestinal de M. brassicae és específica i que la proteïna Vip3Ca competeix pels mateixos llocs d'unió que la proteïna Vip3Aa, es van realitzar assaigs d’unió amb les proteïnes Vip3 marcades amb biotina. La competència homòloga va mostrar que les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca s’uneixen de manera específica a les vesícules de membrana de vora en raspall (BBMV) perquè les respectives proteïnes Vip3 no marcades poden desplaçar les proteïnes homòlogues. Els experiment de competència heteròloga van indicar que Vip3Ca i Vip3Aa comparteixen llocs d'unió indicant per primera vegada que diferents famílies de proteïnes Vip3 competeixen pels mateixos llocs d’unió. El fet que les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca competeixen pels mateixos llocs d’unió té importants implicacions en la gestió del control de plagues. La combinació de les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca no seria optima per al control d’espècies d’insectes plaga, perquè l’aparició de resistència a la Vip3Aa (per modificació del receptor) provocaria al mateix temps la presencia de resistència creuada cap a la Vip3Ca. (III) Resposta de la mort cel·lular de S. exigua intoxicada amb Vip3Ca2. L'elecció de S. exigua es va deure al fet que publicacions anteriors descrivien un conjunt de 47 gens en S. exigua que responien a la intoxicació de la proteïna Vip3A. L'anàlisi d'expressió gènica dels 47 gens candidats indica que el nombre de gens de S. exigua que responen és dependent de la dosi, on el nombre màxim de gens que responien es trobaren a la dosi de 10.000 ng/cm2. En quant als gens sobre-expressats a les diferents dosis provades, els resultats indiquen que es troben implicats en el sistema immune i la modulació hormonal, mentre que els gens reprimits participen en el procés de digestió i la permeabilitat a la membrana . A més, el gen que codifica un component de la ruta Jak-Stat es va trobar reprimit després de 24 hores d'exposició a la dosi més alta provada. Pel que respecta a l’efecte de les proteïnes Vip3Ca i Vip3Aa a les dosis utilitzades en l’epiteli intestinal, els resultats indiquen que la presència de dany (medit com l'alliberament d'aminopeptidasa N) és major quan les larves són exposades a la proteïna Vip3Aa més que quan són exposades a concentracions que produeixen una inhibició del creixement > 99% de la proteïna Vip3Ca. Hem de fer notar que també es mesura el cost biològic associat a la intoxicació amb les proteïna Vip3Ca i Vip3Aa on les larves de S. exigua mostraren un augment en el temps de pupació i una reducció del percentatge de pupació. Per determinar si la repressió de la via Jak-Stat està implicada en l'apoptosi, es va mesurar el nivell d'expressió de les caspases de S. exigua (Se-caspasa-1, Se-caspasa-2, Se-caspasa-3, Se-caspasa-4, Se-caspas

A Genomic and Proteomic Approach to Identify and Quantify the Expressed Bacillus thuringiensis Proteins in the Supernatant and Parasporal Crystal

The combined analysis of genomic and proteomic data allowed us to determine which cry and vip genes are present in a Bacillus thuringiensis (Bt) isolate and which ones are being expressed. Nine Bt isolates were selected from Spanish collections of Bt based on their vip1 and vip2 gene content. As a first step, nine isolates were analyzed by PCR to select those Bt isolates that contained genes with the lowest similarity to already described vip1 and vip2 genes (isolates E-SE10.2 and O-V84.2). Two selected isolates were subjected to a combined genomic and proteomic analysis. The results showed that the Bt isolate E-SE10.2 codifies for two new vegetative proteins, Vip2Ac-like_1 and Sip1Aa-like_1, that do not show expression differences at 24 h vs. 48 h and are expressed in a low amount. The Bt isolate O-V84.2 codifies for three new vegetative proteins, Vip4Aa-like_1, Vip4Aa-like_2, and Vip2Ac-like_2, that are marginally expressed. The Vip4Aa-like_1 protein was two-fold more abundant at 24 h vs. 48 h, while the Vip4Aa-like_2 was detected only at 24 h. For Vip2Ac-like_2, no differences in expression were found at 24 h vs. 48 h. Moreover, the parasporal crystal of the E-SE10.2 isolate contains a single type of crystal protein, Cry23Aa-like, while the parasporal crystal from O-V84.2 contains three kinds of crystal proteins: 7.0-9.8% weight of Cry45Aa-like proteins, 35-37% weight of Cry32-like proteins and 2.8-4.3% weight of Cry73-like protein

Domain shuffling between Vip3Aa and Vip3Ca: chimera stability and insecticidal activity against European, American, African, and Asian pests

The bacterium Bacillus thuringiensis produces insecticidal Vip3 proteins during the vegetative growth phase with activity against several lepidopteran pests. To date, three different Vip3 protein families have been identified based on sequence identity: Vip3A, Vip3B, and Vip3C. In this study, we report the construction of chimeras by exchanging domains between Vip3Aa and Vip3Ca, two proteins with marked specificity differences against lepidopteran pests. We found that some domain combinations made proteins insoluble or prone to degradation by trypsin as most abundant insect gut protease. The soluble and trypsin-stable chimeras, along with the parental proteins Vip3Aa and Vip3Ca, were tested against lepidopteran pests from different continents: Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera, Mamestra brassicae, Anticarsia gemmatalis, and Ostrinia furnacalis. The exchange of the Nt domain (188 N-terminal amino acids) had little effect on the stability and toxicity (equal or slightly lower) of the resulting chimeric protein against all insects except for S. frugiperda, for which the chimera with the Nt domain from Vip3Aa and the rest of the protein from Vip3Ca showed a significant increase in toxicity compared to the parental Vip3Ca. Chimeras with the C-terminal domain from Vip3Aa (from amino acid 510 of Vip3Aa to the Ct) with the central domain of Vip3Ca (amino acids 189–509 based on the Vip3Aa sequence) made proteins that could not be solubilized. Finally, the chimera including the Ct domain of Vip3Ca and the Nt and central domain from Vip3Aa was unstable. Importantly, an insect species tolerant to Vip3Aa but susceptible to Vip3Ca, such as Ostrinia furnacalis, was also susceptible to chimeras maintaining the Ct domain from Vip3Ca, in agreement with the hypothesis that the Ct region of the protein is the one conferring specificity to Vip3 proteins.This research was supported to JF by the Spanish Ministry of Economy and Competitivity (Grants Ref. AGL2015‐70584‐C02‐1‐R and RTI2018‐095204‐B‐C21), by the Generalitat Valenciana (GVPROMETEOII‐2015‐ 001), and by European FEDER funds. JGC was recipient of a PhD grant from the Spanish Ministry of Economy and Competitivity (grant ref. BES‐2013‐065848 and EEBB‐I‐17‐12367). Support was also provided to JLJ‐F by an Agriculture and Food Research Initiative Foundational Program competitive grant (No. 2018‐67013‐27820) from the USDA National Institute of Food and Agriculture, and to KH by a grant 'Key Project for Breeding Genetically Modified Organisms' from China (grant ref. 2016ZX08003‐001)

Proteolytic processing and in vivo binding of the Bacillus thuringiensis Vip3Ca insecticidal protein

Trabajo presentado en la 15th Meeting of the IOBC-WPRS Working Group “Microbial and Nematode Control of Invertebrate Pests”, celebrada en Riga del 7 al 11 de junio de 2015.A screening of collections of Bacillus thuringiensis strains led to the discovery of novel vip3 genes encoding the new family of Vip proteins Vip3Ca (Palma et al., 2012, Appl. Environ. Microbiol. 78: 7163). The present study examines the insecticidal spectrum of the Vip3Ca protein and reports the first results on the mode of action of this protein. The proteolytic processing of Vip3Ca was studied by incubating the protoxin with midgut juice from a susceptible insect (Mamestra brassicae), a moderately susceptible insect (Agrotis ipsilon) and nonsusceptible insect (Ostrinia nubilalis). In all cases, the ca. 90 kDa protoxin was converted into a ca. 60 kDa toxin, suggesting that the activation is not critical in determining the susceptibility of an insect species. Binding of Vip3Ca to the epithelial membrane of M. brassicae midgut larvae was shown after ingestion of the protoxin and further detection with an anti-Vip3 protoxin polyclonal antibody. The binding experiment was carried out in parallel with Vip3Aa, a more potent toxin against this insect species, and with a nontoxic Vip3 protein. Histopathological inspection showed swelling of the epithelial cells with further disruption, which suggests that the mode of action of Vip3Ca is similar to that described for Vip3Aa.Peer Reviewe

Insecticidal spectrum and mode of action of the Bacillus thuringiensis Vip3Ca insecticidal protein

The Vip3Ca protein, discovered in a screening of Spanish collections of Bacillus thuringiensis, was known to be toxic to Chrysodeixis chalcites, Mamestra brassicae and Trichoplusia ni. In the present study, its activity has been tested with additional insect species and we found that Cydia pomonella is moderately susceptible to this protein. Vip3Ca (of approximately 90 kDa) was processed to an approximately 70 kDa protein when incubated with midgut juice in all tested species. The kinetics of proteolysis correlated with the susceptibility of the insect species to Vip3Ca. The activation was faster to slower in the following order: M. brassicae (susceptible), Spodoptera littoralis (moderately susceptible), Agrotis ipsilon and Ostrinia nubilalis (slightly susceptible). Processing Vip3Ca by O. nubilalis or M. brassicae midgut juice did not significantly changed its toxicity to either insect species, indicating that the low susceptibility of O. nubilalis is not due to a problem in the midgut processing of the toxin. M. brassicae larvae fed with Vip3Ca showed binding of this toxin to the apical membrane of the midgut epithelial cells. Histopathological inspection showed sloughing of the epithelial cells with further disruption, which suggests that the mode of action of Vip3Ca is similar to that described for Vip3Aa. Biotin-labeled Vip3Ca and Vip3Aa bound specifically to M. brassicae brush border membrane vesicles and both toxins competed for binding sites. This result suggests that insects resistant to Vip3A may also be cross-resistant to Vip3C, which has implications for Insect Resistance Management (IRM).Fil: Gomis-Cebolla, Joaquín. Universidad de Valencia; EspañaFil: Ruiz de Escudero, Iñigo. Universidad Publica de Navarra; EspañaFil: Vera-Velasco, Natalia Mara. Universidad de Valencia; EspañaFil: Hernández-Martínez, Patricia. Universidad de Valencia; EspañaFil: Hernández-Rodríguez, Carmen Sara. Universidad de Valencia; EspañaFil: Ceballos, Tomás. Universidad de Valencia; EspañaFil: Palma, Leopoldo. Universidad Publica de Navarra; España. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones y Transferencia de Villa María. Universidad Nacional de Villa María. Centro de Investigaciones y Transferencia de Villa María; ArgentinaFil: Escriche, Baltasar. Universidad de Valencia; EspañaFil: Caballero, Primitivo. Universidad Publica de Navarra; EspañaFil: Ferré, Juan. Universidad de Valencia; Españ