Improvement in the amino-acid microbial production

Amino-acid microbial production can be improved by a process modification or by inducing changes in the metabolism of the biocatalyst. These two approaches will be illustrated and discussed using the examples of glutamic acid and valine productions with Corynebacterium glutamicum.La production d'acide aminé par voie microbienne peut être améliorée soit en jouant sur le procédé de culture soit en modifiant le métabolisme du micro-organisme producteur. Ces 2 approches seront illustrées et discutées grâce à deux exemples d'acides aminés produits par Coryne-bacterium glutamicum: l'acide glutamique et la valine

Étude cinétique et métabolique de Corynebacterium glutamicum 2262 au cours de la fermentation glutamique (instabilité de la production de glutamate en procédé continu thermo-induit)

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Influence des précurseurs de la glycosylation sur la macrohétérogénéité de l'IFN-g produit en bioréacteur par des cellules CHO

L'objectif de ce travail était l'étude des facteurs intracellulaires responsables de la macrohétérogénéité de la glycosylation de l'interféron-gamma humain recombinant (IFN) produit en bioréacteur par des cultures discontinues et semi-continues de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary). L'analyse des précurseurs oligosaccharidiques a révélé que la structure des glycannes associés aux dol-PP-oligosaccharides demeure constante tout au long du procédé. En revanche, l'hypothèse d'une limitation quantitative des structures glycanniques pouvait être envisagée. De plus, la diminution précoce des pools intracellulaires de nucléotides triphosphates et de la charge énergétique semblait être reliée à la diminution de la glycosylation. Cette hypothèse est renforcée par le fait que le profil de glycosylation de l'IFN est constant et la charge énergétique maintenue à une valeur élevée durant la phase de production de la glycoprotéine lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu de culture richeThe aim of this work was the study of intracellular factors responsible for the macroheterogeneity of recombinant human IFN-gamma (IFN) glycosylation produced in bioreactor during batch and fed-batch cultures of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Analysis of oligosaccharide precursors revealed that the structure of the lipid-linked oligosaccharides was constant over the batch process. On the contrary, the hypothesis of a quantitative limitation of the glycan structures could not be excluded. Moreover, the decline in intracellular nucleotide triphosphates and adenylate energy charge could be linked to the decrease in IFN glycosylation. This is supported by an unchanged pattern of IFN glycosylation when the cells displayed a high adenylate energy charge in a rich culture mediumNANCY/VANDOEUVRE-INPL (545472102) / SudocSudocFranceF

Influence des conditions de culture sur la quantité de l'INF-[gamma] recombinant produit par des cellules CHO au cours de procédés discontinus

Au cours de cette étude, nous avons approfondi nos connaissances concernant l effet des conditions de culture sur la quantité et la qualité d une protéine recombinante produite par des cellules CHO. En particulier, nous avons étudié l influence de 3 composés (citrate de fer, pluronic F-68 et éthanolamine) présents dans le milieu BDM mais absent du milieu RPMI avec sérum (FCS-RPMI) sur la croissance des cellules CHO, la production de l interféron-gamma humain recombinant (IFN-g) ainsi que sa qualité. L ajout de pluronic F-68 (0,1%) et de citrate de fer (500 M) dans le milieu RPMI sans sérum a permis d obtenir une croissance cellulaire comparable à celle obtenue avec le milieu FCS-RPMI. Par ailleurs, dans ces conditions de culture, la production de l IFN-g est également augmentée. L ajout de citrate de fer dans le milieu FCS-RPMI permet non seulement d améliorer la croissance des cellules CHO mais également la production de l IFN-g. Avec le milieu FCS-RPMI, la macrohétérogénéité de la glycosylation de l IFN-g change au cours du procédé discontinu, cette dernière est maintenue constante uniquement lorsque du citrate de fer est ajouté à ce même milieu de culture. En outre, des activités gélatinase et caséinase appartenant aux familles des métalloprotéases et des protéases à sérine ont été mises en évidence au cours des cultures de cellules CHO. Quel que soit le milieu utilisé (RPMI, BDM avec ou sans sérum), l ajout de citrate de fer permet de maîtriser et d éviter la protéolyse de l IFN-g. Enfin, la relation entre le degré de glycosylation macroscopique de l IFN- g et son activité biologique (immunomodulatrice) in-vitro a été établieIn this study, we characterized the effect of culture conditions on the quantity and the quality of a recombinant protein, IFN-g, produced by CHO cells. In particular, we studied the effect of 3 components (iron citrate, pluronic F-68 and ethanolamine) that are present in the BDM medium, but completely lacking in RPMI serum medium (FCS-RPMI) on CHO cell growth, as well as the production and quality of recombinant IFN-g.The addition of Pluronic F-68 (0.1%) and iron citrate (500 M) in RPMI without serum resulted in growth kinetic performances similar to those observed in FCS-RPMI. Furthermore, in these culture conditions, IFN- g production was improved. Addition of iron citrate in FCS-RPMI improved cell growth, as well as IFN-g production. Whereas the glycosylation pattern of recombinant IFN-g produced by CHO cells was not constant when the culture was performed in FCS-RPMI, the glycosylation pattern of IFN-g remained constant when iron citrate was added in the medium. In addition, gelatinase and caseinase enzymatic activities in CHO batch cultures were detected, due most likely to enzymes of the metalloproteases and serine protease families. Despite the type of medium used (RPMI, BDM with or without serum), addition of iron citrate minimized IFN-g proteolysis. Finally, the relationship between the macroglycosylation pattern of IFN-g and its in-vitro biological (immunomodulatory) activity was demonstratedNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF

Solubilization of phenanthrene above cloud point of Brij 30: A new application in biodegradation

International audienceIn the present study a new application of solubilization of phenanthrene above cloud point of Brij 30 in biodegradation was developed. It was shown that a temporal solubilization of phenanthrene above cloud point of Brij 30 (5 wt%) permitted to obtain a stable increase of the solubility of phenanthrene even when the temperature was decreased to culture conditions of used microorganism Pseudomonas putida (28 degrees C). A higher initial concentration of soluble phenanthrene was obtained after the cloud point treatment: 200 against 120 mu M without treatment. All soluble phenanthrene was metabolized and a higher final concentration of its major metabolite - 1-hydroxy-2-naphthoic acid - (160 against 85 mu M) was measured in the culture medium in the case of a preliminary cloud point treatment. Therefore a temporary solubilization at cloud point might have a perspective application in the enhancement of biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons

Importance de l'enveloppe cellulaire dans la régulation de la production de glutamate par Corynebacterium glutamicum 2262 au cours d'un procédé thermo-induit

Lors de ce travail, une étude comparative entre trois souches de C. glutamicum a été réalisée. Celles-ci sont C. glutamicum 2262, une souche surproductrice de glutamate suite à l élévation de température du milieu de culture de 33 à 39C, C. glutamicum 2262 NP un variant incapable d excréter du glutamate dans ces mêmes conditions et C. glutamicum 2262 pks13 un mutant dépourvu de bicouche mycolique externe. Un modèle métabolique original reprenant les différentes modifications physiologiques aboutissant à l excrétion du glutamate au cours du procédé thermo-induit a été établi. La bicouche mycolique joue un rôle primordial puisque son absence affecte sévèrement la production du glutamate. Dans un premier temps, l élévation de température serait ressentie au niveau de cette bicouche. Ce ressenti, visualisé par l accumulation de protéines caractéristiques d un stress thermique, est nécessaire pour que la bactérie soit en capacité de surproduire le glutamate. Par la suite, la production de glutamate est régulée au niveau de l a-cétoglutarate déshydrogénase (ODH) grâce à la phosphoprotéine OdhI. Suite au changement de température, celle-ci est déphosphorylée ce qui lui permet d interagir avec ODH et de provoquer l inhibition de cette dernière. Ceci se traduit par la redirection sur flux carboné vers la synthèse du glutamate. Aucun de ces évènements n est observé chez C. glutamicum 2262 pks13. Par ailleurs, l élévation de température induit une modification de la composition de l enveloppe cellulaire qui semble intervenir dans le processus physiologique aboutissant à l excrétion du glutamate puisque très peu de changements sont observés chez C. glutamicum 2262 NPDuring this work, a comparative study between three strains of Corynebacterium glutamicum was carried out. These strains were C. glutamicum 2262 which overproduces glutamate after an increase in the culture temperature from 33 to 39C, C. glutamicum 2262 NP which is unable to produce glutamate in the same culture conditions and C. glutamicum 2262 pks13 devoid of outer corynomycolic acid bilayer. An original metabolic model describing the successive physiological modifications responsible for the glutamate excretion during the temperature-triggered process was established. The presence of the corynomycolic acid bilayer appeared to be necessary since its lack affected dramatically the glutamate production. The temperature increase would be first sensed at the level of the external corynomycolic acid layer. This sensing was visualised through the accumulation of thermal stress proteins. In C. glutamicum 2262 pks13, the synthesis of these proteins was not induced. The glutamate production is regulated at the oxoglutarate dehydrogenase (ODH) level by the phosphoprotein OdhI. A consequence of the temperature increase was the dephosphorylation of this regulatory protein and its interaction with ODH, provoking its inhibition. The carbon flux was then reoriented toward the glutamate synthesis. In C. glutamicum 2262 pks13, no dephosphorylation of OdhI and no change in the ODH activity were not determined. The thermal stress also induced a change in the composition of the corynomycolic acid layer which was correlated with the ability of C. glutamicum 2262 to overproduce glutamate. In C. glutamicum 2262 NP, the composition of the corynomycolic acid layer remained unchangedNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF