Charakterisierung des Zytoskelett-Proteins Villidin und einer dritten Profilin-Isoform in Dictyostelium discoideum

A large number of actin-binding proteins regulates the dynamics of the actin cytoskeleton. Here we report the identification and characterization of two new proteins in Dictyostelium discoideum: the novel cytoskeleton protein villidin and a third profilin isoform. One goal of the project was to analyze the features of the villidin sequence in detail and to investigate the protein by molecular, biochemical and cell biological approaches. Villidin has a calculated molecular mass of 190,000 Da. Based on the domain structure of the protein, villidin can be assigned to the gelsolin/villin-family as well as to the WD-repeat family. In principal, the group of the WD-repeat proteins includes regulatory proteins which are involved in signal transduction and other important cellular processes. The N-terminus of villidin harbours between four and eight of the specific WD-repeats and forms probably a β-propeller structure. The WD-domain is followed by an intervening domain of 400 amino acids that leads to the second characteristic villidin domain at the C-terminus. This part of the sequence exhibits a similarity to villin, though the first of the six villin domains is absent in villidin. However the typical headpiece is present. Villidin mRNA and protein are expressed in low amounts during growth and early aggregation, they are increased during development and reach highest levels at the tipped aggregate stage. The protein is present in the cytosol as well as in the cytoskeletal and the membrane fraction. These biochemical results are in agreement with the immunofluorescence data. The endogenous villidin is homogeneously distributed throughout the cytosol and localizes at vesicular structures. Colocalization experiments lead to the assumption that these structures might belong to a still unknown population of vesicles. GFP fusion proteins with the villin homology domains show a similar distribution, whereas GFP fusions of the N-terminal part encompassing the WD-repeats are present in F-actin rich regions at the plasma membrane and on internal membranes during motility, pinocytosis and phagocytosis. Mutants lacking villidin do not show an aberrant phenotype during growth and development but are defective in motility and phototaxis in the multicellular slug stage. Based on this defect and the multidomain structure of the protein, villidin might be involved in signal transduction processes leading to phototactic movement. The second part of the project dealt with a new gene which codes for a third profilin isoform in D. discoideum. The well-known Dictyostelium profilin isoforms I and II are able to interact with G-actin, PIP2 and poly-L-prolin. As in the case of profilin I and II, profilin III is encoded by a single gene. In contrast to profilin I and II, the transcription of profilin III is not developmentally regulated. All three isoforms show the typical limited homology at the amino acid level. The recombinant Profilin III protein cosediments with poly-L-prolin, inhibits the actin-polymerisation and the PIP2 interaction of profilin III competes with the G-actin affinity. The low expression of Profilin III mRNA in growing and developing cells suggests a distinct role of profilin III because a low protein concentration argues against an actin sequestering function.Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen beeinflußt die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Dictyostelium-Amöben zwei neue Proteine beschrieben: das neuartige Zytoskelett-Protein Villidin und eine dritte Profilin-Isoform. Ziel des ersten Teilprojekts war es charakteristische Besonderheiten der Villidin-Sequenz detailliert zu analysieren sowie durch molekularbiologische, biochemische und zellbiologische Versuchsansätze das Protein näher zu beschreiben. Villidin ist ein 190 kDa großes Molekül, das aufgrund seiner Domänenstruktur sowohl der Gelsolin/Villin- als auch der „WD-repeat“-Familie zugeordnet wird. Die Gruppe der „WD-repeat“-Proteine umfaßt hauptsächlich regulatorische Proteine, die bei der Signaltransduktion und anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt sind. Am Aminoende von Villidin finden sich vier bis acht der Familien-typischen Wiederholungseinheiten, die wahrscheinlich eine β-Propellerstruktur ausbilden können. Der „WD-repeat“-Domäne schließt sich eine 400 Aminosäure lange Region an, die die Verbindung zu der zweiten charakteristischen Villidin-Domäne am C-Terminus herstellt. Diese zeichnet sich durch eine auffallende Ähnlichkeit zu Villin aus, allerdings fehlt die erste der sechs Familien-typischen Gelsolin/Villin-Domänen in Villidin, doch das markante zusätzliche C-terminale „headpiece“-Segment ist vorhanden. Die VillidinmRNA ebenso wie das Protein werden in der Wachstumsphase und der frühen Zellaggregation nur schwach exprimiert. Die Konzentration steigt im Verlauf der Entwicklung stetig an und erreicht vor der Kulmination ein Maximum. Das Protein liegt sowohl zytosolisch als auch Zytoskelett- und Membran-assoziiert vor. Diese biochemischen Befunde stimmen gut mit den Immunfluoreszenzergebnissen überein. Das endogene Villidin ist gleichmäßig über das Zytosol verteilt und lokalisiert an vesikulären Strukturen. Aufgrund von Kolokalisationsversuchen ist davon auszugehen, daß es sich hierbei um eine noch nicht identifizierte Vesikelpopulation handelt. GFP-Fusionen mit der Villin-Domäne lassen eine dem endogenen Protein vergleichbare Verteilung über das Zytosol beobachten. Eine Lokalisation zusammen mit F-Aktin während Pinozytose und Phagozytose war nur für Fusionsproteine mit der „WD-repeat“-Domäne zu beobachten. Die Untersuchung von Villidin-minus-Mutanten zeigte einen Phototaxisdefekt im Stadium des Pseudoplasmodiums. In Hinblick auf diesen Defekt und die Domänenstruktur von Villidin wird eine Rolle in der Signaltransduktion vermutet. Das zweite Teilprojekt beinhaltete den molekularbiologischen Nachweis der dritten Profilin- Isoform in D. discoideum sowie die biochemische Analyse der in vitro Funktion eines rekombinant exprimierten Profilin III. Die bekannten Dictyostelium-Profilin-Isoformen I und II sind in der Lage mit G-Aktin, PIP2 und poly-L-Prolin zu interagieren. Ebenso wie Profilin I und II wird Profilin III durch ein einzelnes Gen kodiert. Die Transkription von Profilin III zeigt im Gegensatz zu Profilin I und II keine Entwicklungsregulation. Alle drei Isoformen zeichnen sich durch das Auftreten typischer, hochkonservierter Aminosäuren in der C-terminalen Aktin- und der N-terminalen poly-L-Prolin-bindenden Region aus. Die funktionellen Eigenschaften des rekombinant exprimierten, 13 kDa großen Profilin III korrespondieren mit dieser Sequenzstruktur. Das rekombinante Protein kosedimentiert mit poly-L-Prolin und hemmt deutlich die Aktin-Polymerisation, wobei die PIP2- Interaktionsfähigkeit mit der G-Aktin-Affinität konkurriert. Die geringe Expression der Profilin III-mRNA spricht gegen eine mögliche Aktin-sequestierende Funktion. Da Profilin Iund II-Transkripte gegen Ende der Entwicklung fast ganz verschwinden, die Profilin IIImRNA hingegen stets konstant transkribiert wird, werden unterschiedliche Aufgaben für die drei Isoformen vermutet

Profilin isoforms in Dictyostelium discoideum

AbstractEukaryotic cells contain a large number of actin binding proteins of different functions, locations and concentrations. They bind either to monomeric actin (G-actin) or to actin filaments (F-actin) and thus regulate the dynamic rearrangement of the actin cytoskeleton. The Dictyostelium discoideum genome harbors representatives of all G-actin binding proteins including actobindin, twinfilin, and profilin. A phylogenetic analysis of all profilins suggests that two distinguishable groups emerged very early in evolution and comprise either vertebrate and viral profilins or profilins from all other organisms. The newly discovered profilin III isoform in D. discoideum shows all functions that are typical for a profilin. However, the concentration of the third isoform in wild type cells reaches only about 0.5% of total profilin. In a yeast-2-hybrid assay profilin III was found to bind specifically to the proline-rich region of the cytoskeleton-associated vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP). Immunolocalization studies showed similar to VASP the profilin III isoform in filopodia and an enrichment at their tips. Cells lacking the profilin III isoform show defects in cell motility during chemotaxis. The low abundance and the specific interaction with VASP argue against a significant actin sequestering function of the profilin III isoform

Villidin, a Novel WD-repeat and Villin-related Protein from Dictyostelium, Is Associated with Membranes and the Cytoskeleton

Villidin is a novel multidomain protein (190 kDa) from Dictyostelium amoebae containing WD repeats at its N-terminus, three PH domains in the middle of the molecule, and five gelsolin-like segments at the C-terminus, followed by a villin-like headpiece. Villidin mRNA and protein are present in low amounts during growth and early aggregation, but increase during development and reach their highest levels at the tipped mound stage. The protein is present in the cytosol as well as in the cytoskeletal and membrane fractions. GFP-tagged full-length villidin exhibits a similar distribution as native villidin, including a distinct colocalization with Golgi structures. Interestingly, GFP fusions with the gelsolin/villin-like region are uniformly dispersed in the cytoplasm, whereas GFP fusions of the N-terminal WD repeats codistribute with F-actin and are associated with the Triton-insoluble cytoskeleton. Strains lacking villidin because of targeted deletion of its gene grow normally and can develop into fruiting bodies. However, cell motility is reduced during aggregation and phototaxis is impaired in the mutant strains. We conclude that villidin harbors a major F-actin binding site in the N-terminal domain and not in the villin-like region as expected; association of villidin with vesicular membranes suggests that the protein functions as a linker between membranes and the actin cytoskeleton