Clinical utility of Next Generation Sequencing of plasma cell-free DNA for the molecular profiling of patients with NSCLC at diagnosis and disease progression

Background: The present study evaluates the utility of NGS analysis of circulating free DNA (cfDNA), which incorporates small amounts of tumor DNA (ctDNA), at diagnosis or at disease progression (PD) in NSCLC patients. Methods: Comprehensive genomic profiling on cfDNA by NGS were performed in NSCLC patients at diagnosis (if tissue was unavailable/insufficient) or at PD to investigate potential druggable molecular aberrations. Blood samples were collected as routinary diagnostic procedures, DNA was extracted, and the NextSeq 550 Illumina platform was used to run the Roche Avenio ctDNA Expanded Kit for molecular analyses. Gene variants were classified accordingly to the ESCAT score. Results: A total of 106 patients were included in this study; 44 % of cases were requested because of tissue unavailability at the diagnosis and 56 % were requested at the PD. At least one driver alteration was observed in 62 % of cases at diagnosis. Driver druggable variants classified as ESCAT level I were detected in 34 % of patients, including ALK-EML4, ROS1-CD74, EGFR, BRAF, KRAS p.G12C, PI3KCA. In the PD group, most patients were EGFR-positive, progressing to a first line-therapy. Sixty-three percent of patients had at least one driver alteration detected in blood and 17 % of patients had a known biological mechanism of resistance allowing further therapeutic decisions. Conclusions: The present study confirms the potential of liquid biopsy to detect tumour molecular heterogeneity in NSCLC patients at the diagnosis and at PD, demonstrating that a significant number of druggable mutations and mechanisms of resistance can be detected by NGS analysis on ctDNA

L'emogasanalisi cordonale nella buona pratica clinica.

Background: La compromissione dell'ossigenazione materna, la ridotta perfusione placentare o la presenza di un ostacolo al passaggio di sangue ossigenato al livello della placenta comportano un ridotto apporto di ossigeno al feto realizzando una condizione di ipossia con conseguente passaggio dal metabolismo aerobio a quello anaerobio. Il metabolismo anaerobio porta alla produzione di acidi organici che tendono ad accumularsi determinando variazioni del pH inizialmente compensate dall'azione dei sistemi tampone, quando questi si esauriscono compare acidosi metabolica o mista e si realizza una condizione definita asfissia perinatale, la sua persistenza danneggia il cervello del feto causando un quadro di encefalopatia ipossico-ischemica. Ad oggi il miglior approccio terapeutico per attenuare i danni dell’encefalopatia è l’ipotermia iniziata entro sei ore dalla nascita. Uno dei criteri necessari per definire se è opportuno iniziare il trattamento è rappresentato dalla presenza di pH 12 mmll\l all’emogasanalisi arteriosa cordonale eseguito entro la prima ora di vita. L’emogasanalisi cordonale è dunque un esame importante per valutare lo stato di salute del neonato ed occorre che sia eseguito correttamente per essere attendibile. Inoltre si discute ancora se sia opportuno eseguire il prelievo cordonale in tutti i neonati o piuttosto se sia meglio eseguirlo selettivamente in presenza di specifiche indicazioni. Obiettivi: Lo scopo della tesi è stato quello di valutare, nell’ottica della Good Clinical Practice, l’utilizzo dell’emogasanalisi cordonale come strumento di indice di sofferenza perinatale per poterindividuare ed eventualmente correggere le non conformità, l’errato utilizzo del device e i possibili rischi associati a questa pratica clinica. In particolar modo abbiamo cercato di individuare eventuali errori preanalitici nell’esecuzione dell’emogasanalisi cordonale al fine di ottimizzare la procedura e di verificare se l’effettuazione universale dell’emogasanalisi cordonale in tutti i neonati rappresenta un vantaggio rispetto all’approccio più selettivo con indicazione dell’esecuzione solo in casi codificati. Metodi: In questo studio sono stati inclusi tutti i bambini nati presso l’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana dal 1°gennaio 2015 al 15 aprile 2015 con età gestazionale ≥35 settimane e peso alla nascita ≥1800gr. Per ciascun neonato sono stati presi in esame i dati relativi all’anamnesi materna, al travaglio, al parto, all’adattamento extrauterino del neonato correlati all’emogasanalisi cordonale. Inoltre è stata esaminata la distribuzione dei neonati in relazione al turno di servizio (mattina-pomeriggio-notte). Risultati: Dei 500 neonati screenati ne sono stati arruolati 424 (85%) per i quali è disponibile sia l’emogasanalisi arteriosa che quella venosa. 25 emogasanalisi (5,9%) sono risultate patologiche con pH arterioso -12mmol. Rispetto ai criteri stabiliti in letteratura sono risultati attendibili 291 campioni (68,6%). Queste emogasanalisi vengono definite affidabili perché rispettano tutti e tre i parametri stabiliti: pH arterioso di almeno 0,02 ≤ a pH venoso, pCO₂ arteriosa di almeno 5,25 mmHg > della pCO₂ venosa e pCO₂ venosa > 21,75 mmHg. Un ulteriore parametro di affidabilità che risulta rispettato in tutte le Ega è la pO₂ arteriosa < 38mmHg. Il 31% delle emogasanalisi studiate vengono definite non affidabili (ai fini di una precisa diagnosi) perché il campione ottenuto nei due prelievi ha possibile origine venosa o da sangue misto. I nostri risultati mostrano come: - In tutti i campioni di sangue non ci sono differenze tra Htc arterioso e venoso spie di una possibile confusione di campioni. - Il tipo di parto e quindi la possibile presenza di condizioni di urgenza, ed il turno di servizio non hanno influenzato l’esecuzione del prelievo né nei neonati con emogasanalisi normale né in quelli con emogasanalisi patologica. - Le diverse variabili considerate non hanno influenzato i valori dell’emogasanalisi (affidabili e non affidabili), eccetto che per le correlazioni tra pH arterioso e durata del travaglio e tra pH arterioso e punteggio di Apgar al 5’ caratterizzate rispettivamente da riduzione del pH all’aumentare della durata del travaglio e da riduzione del pH per valori bassi di Apgar. Conclusioni: L’emogasanalisi cordonale è risultata essere corretta nella maggior parte dei casi con prelievo eseguito sia dall’arteria che dalla vena ombelicale; non risultano errori preanalitici (bolle d’aria, emolisi, sedimentazione). L’effettuazione dell’Emogasanalisi cordonale in tutti i neonati favorirsce maggiore praticità ed attenzione nell’esecuzione del prelievo. Questo porta ad avere un campione più affidabile ed utile nella sua interpretazione; inoltre essendo un esame sicuro, poco invasivo e fornendo importanti informazioni sulle condizioni cliniche dei neonati dopo il parto, si rivela un ottimo ausilio di routine. La quantità di campione di cui si necessita per l’analisi è minima e la sua raccolta non intralcia eventuali altre raccolte come la donazione di sangue cordonale. Poiché la raccolta di sangue cordonale, a cordone correttamente clampato e conservato, è possibile fino ad un’ora dopo il parto, l’esecuzione dell’emogasanalisi non va a intralciare nemmeno la pratica del clampaggio ritardato

CDK4/6 Inhibitors Overcome Endocrine ESR1 Mutation-Related Resistance in Metastatic Breast Cancer Patients

ESR1 mutations contribute to endocrine resistance and occur in a high percentage of hormone-receptor-positive (HR+) metastatic breast cancer (mBC) cases. Cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitors (CDK4/6i) changed the treatment landscape of HR+ mBC, as they are able to overcome estrogen resistance. The present retrospective study investigates the clinical benefit of CDK4/6i in ESR1 mutant HR+ mBC patients treated with a CDK4/6i as first- or second-line therapy. Plasma was collected at baseline prior to CDK4/6i plus hormone therapy as a first- or second-line treatment. Circulating free DNA (cfDNA) was extracted from plasma, and ESR1 mutation analysis was performed on a ddPCR. Statistical analyses were performed to investigate the predictive power of ESR1 mutations and any association with clinical factors. A total of 42 patients with mBC treated with CDK4/6i plus endocrine therapy as first- (n = 35) or second-line (n = 7) were enrolled. Twenty-eight patients received hormonal therapy (AI or tamoxifen) in the adjuvant setting. ESR1 mutation status in blood was associated with shorter median disease-free survival (DFS) (30 vs. 110 months; p = 0.006). Multivariate analysis confirmed ESR1 mutations as independent factors of resistance in adjuvant hormone therapy. On the contrary, no difference in progression-free survival (PFS) was observed in the presence or absence of an ESR1 mutation in patients treated with CDK4/6i as first-line treatment (p = 0.29). No statistically significant correlation between the best response to CDK4/6i and ESR1 mutation was found (p = 0.46). This study indicates that the ESR1 mutation detected in cfDNA is an independent predictive factor of clinical recurrence in the adjuvant setting and that CDK4/6i can overcome ESR1-dependent resistance

Understanding mechanisms of resistance to FLT3 inhibitors in adult FLT3-mutated Acute Myeloid Leukemia (AML) to guide treatment strategy

: The presence of FLT3 mutations, including the most common FLT3-ITD (internal tandem duplications) and FLT3-TKD (tyrosine kinase domain), is associated with an unfavorable prognosis in patients affected by Acute Myeloid Leukemia (AML). In this setting, in recent years, new FLT3-inhibitors have demonstrated efficacy in improving survival and treatment response. Nevertheless, the development of primary and secondary mechanisms of resistance poses a significant obstacle to their efficacy. Understanding these mechanisms is crucial for developing novel therapeutic approaches to overcome resistance and improve the outcomes of patients. In this context, the use of novel FLT3 inhibitors and the combination of different targeted therapies have been studied. This review provides an update on the molecular alterations involved in FLT3 AML mechanisms of resistance, exploring how the molecular monitoring may be used to guide treatment strategy in FLT3-mutated AML

IDH1 mutation is detectable in plasma cell-free DNA and is associated with survival outcome in glioma patients

Background Circulating cell-free DNA (cfDNA, liquid biopsy) is a powerful tool to detect molecular alterations. However, depending on tumor characteristics, biology and anatomic localization, cfDNA detection and analysis may be challenging. Gliomas are enclosed into an anatomic sanctuary, which obstacles the release of cfDNA into the peripheral blood. Therefore, the advantages of using liquid biopsy for brain tumors is still to be confirmed. The present study evaluates the ability of liquid biopsy to detect IDH1 mutations and its correlation with survival and clinical characteristics of glioma patients.Methods Blood samples obtained from glioma patients were collected after surgery prior to the adjuvant therapy. cfDNA was extracted from plasma and IDH1 p.R132H mutation analysis was performed on a digital droplet PCR. chi 2-test and Cohen k were used to assess the correlation between plasma and tissue IDH1 status, while Kaplan Meier curve and Cox regression analysis were applied to survival analysis. Statistical calculations were performed by MedCalc and GraphPad Prism software.Results A total of 67 samples were collected. A concordance between IDH1 status in tissue and in plasma was found (p = 0.0024), and the presence of the IDH1 mutation both in tissue (138.8 months vs 24.4, p &lt; 0.0001) and cfDNA (116.3 months vs 35.8, p = 0.016) was associated with longer median OS. A significant association between IDH1 mutation both in tissue and cfDNA, age, tumor grade and OS was demonstrated by univariate Cox regression analysis. No statistically significant association between IDH1 mutation and tumor grade was found (p = 0.10).Conclusions The present study demonstrates that liquid biopsy may be used in brain tumors to detect IDH1 mutation which represents an important prognostic biomarker in patients with different types of gliomas, being associated to OS