Protein Synthesis-Dependent Associative Long-Term Memory in Larval Zebrafish

The larval zebrafish is a model organism to study the neural circuitry underlying behavior. There exist, however, few examples of robust long-term memory. Here we describe a simple, unrestrained associative place-conditioning paradigm. We show that visual access to a group of conspecifics has rewarding properties for 6- to 8-day-old larval zebrafish. We use this social reward as an unconditioned stimulus and pair it with a distinct visual environment. After training, larvae exhibited spatial preference for the location previously paired with the social reward for up to 36 h, indicating that zebrafish larvae can exhibit long-term associative memory. Furthermore, incubation with a protein synthesis inhibitor or an NMDAR-antagonist impaired memory. In future experiments, this learning paradigm could be used to study the social interactions of larval zebrafish or paired with cell-specific metabolic labeling to visualize circuits underlying memory formation

In vivo extracellular recordings of thalamic and cortical visual responses reveal V1 connectivity rules

The brain’s connectome provides the scaffold for canonical neural computations. However, a comparison of connectivity studies in the mouse primary visual cortex (V1) reveals that the average number and strength of connections between specific neuron types can vary. Can variability in V1 connectivity measurements coexist with canonical neural computations? We developed a theory-driven approach to deduce V1 network connectivity from visual responses in mouse V1 and visual thalamus (dLGN). Our method revealed that the same recorded visual responses were captured by multiple connectivity configurations. Remarkably, the magnitude and selectivity of connectivity weights followed a specific order across most of the inferred connectivity configurations. We argue that this order stems from the specific shapes of the recorded contrast response functions and contrast invariance of orientation tuning. Remarkably, despite variability across connectivity studies, connectivity weights computed from individual published connectivity reports followed the order we identified with our method, suggesting that the relations between the weights, rather than their magnitudes, represent a connectivity motif supporting canonical V1 computations

Quantification and analysis of neuropil transcriptome in the central nervous system

Local protein synthesis has re-defined our ideas on the basic cellular mechanisms that underlie synaptic plasticity and memory formation. The population of messenger RNAs that are localised to dendrites, however, remains sparsely identified. Furthermore, neuronal morphological complexity and spatial compartmentalisation require efficient mechanisms for messenger RNA localisation and control over translational efficiency or transcript stability. 3’ untranslated regions, downstream from stop codons, are recognised for providing binding platforms for many regulatory units, thus encoding the processing of the above processes. The hippocampus, a part of the brain involved in the formation, organisation and storage of memories, provides a natural platform to investigate patterns of RNA localisation. The hippocampus comprises tissue layers, which naturally separate the principle neuronal cell bodies from their processes (axons and dendrites). Identifying the full-complement of localised transcripts and associated 3’UTR isoforms is of great importance to understand both basic neuronal functions and principles of synaptic plasticity. These findings can be used to study the properties of neuronal networks as well as to understand how these networks malfunction in neuronal diseases. Here, deep sequencing is used to identify the mRNAs resident in the synaptic neuropil in the hippocampus. Analysis of a neuropil data set yields a list of 8,379 transcripts of which 2,550 are localised in dendrites and/or axons. Using a fluorescent barcode strategy to label individual mRNAs shows that the relative abundance of different mRNAs in the neuropil varies over 5 orders of magnitude. High-resolution in situ hybridisation validated the presence of mRNAs in both cultured neurons and hippocampal slices. Among the many mRNAs identified, a large fraction of known synaptic proteins including signaling molecules, scaffolds and receptors is discovered. These results reveal a previously unappreciated enormous potential for the local protein synthesis machinery to supply, maintain and modify the dendritic and synaptic proteome. Using advances in library preparation for next generation sequencing experiments, the diversity of 3’UTR isoforms present in localised transcripts from the rat hippocampus is examined. The obtained results indicate that there is an increase in 3’UTR heterogeneity and 3’UTR length in neuronal tissue. The evolutionary importance of the 3’UTR diversity and correlation with changes in species,tissue and cell complexity is investigated. The conducted analysis reveals the population of 3’UTR isoforms required for transcript localisation in overall neuronal transcriptome as well as the regulatory elements and binding sites specific for neuronal compartments. The configuration of poly(A) signals is correlated with gene function and can be further exploit to determine similar mechanisms for alternative polyadenylation. Usage of custom specified methods for next-generation sequencing as well as novel approaches for RNA quantification and visualisation necessitate the development and implementation of new downstream analytic methods. Library methods for data-mining transcripts annotation, expression and ontology relations is provided. Usage of a specialised search engine targeting key features of previous experiments is proposed. A processing pipeline for NanoString technology, defining experimental quality and exploiting methods for data normalisation is developed. High-resolution in situ images are analysed by custom application, showing a correlation between RNA quantity and spatial distribution. The vast variety of bioinformatic methods included in this work indicates the importance of downstream analysis to reach biological conclusions. Maintaining the integrability and modularity of our implementations is of great priority, as the dynamic nature of many experimental techniques requires constant improvement in computational analysis.Lokale Proteinsynthese und ihre Bedeutung in der synaptischen Plastizität und Erinnerungsbildung definieren einen neuen Blick auf grundlegende zelluläre Mechanismen. Der Bestand von Boten-RNAs (mRNAs), die auf Dendriten lokalisiert sind, bleibt jedoch wenig bekannt. Weiterhin erfordern neuronale morphologische Komplexität und räumliche Bereichsbildung effiziente Mechanismen für die mRNA-Lokalisierung und Kontrolle über die Translationseffizienz oder Transkriptsstabilität. 3’ untranslatierte Bereiche, stromabwärts (downstream) vom Stop-Codon, sind für die Bereitstellung bindender Plattformen für viele regulative Einheiten erkannt, wodurch die Verarbeitung der obigen Verfahren codiert wird. Der Hippocampus, ein Teil des Gehirns, bei dem Gedächtnisbildung/Erinnerungen, Organisation und Speicherung beteiligt sind, bietet eine natürliche Plattform um Musster von RNA-Lokalisierung zu untersuchen . Der Hippocampus besteht aus Gewebeschichten, die grundsätzliche neuronale Zellkörpern von Ihren Fortsätzen (Axonen und Dendriten) normalerweise trennen. Die Ermittlung der vollständigen Ergänzung von lokalisiertem Transkript und die damit verbundenen 3’ UTR-Isoformen ist von großer Bedeutung, um grundlegende neuronale Funktionen und Prinzipien der synaptischen Plastizität zu verstehen. Solche Forschungsergebnisse können sowohl bei der Untersuchung der neuronalen Eigenschaften der Netzwerkbildung als auch bei den Schlüsselkomponenten von neuronalen Krankheiten angewendet werden. Hier verwenden wir Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden (Deep Sequencing) um die mRNAs zu identifizieren, die in dem synaptischen Neuropil im Hippokampus angesiedelt sind. Die Analyse eines Neuropil Datensatzes ergab eine Liste von 8.379 Transkripten, von denen 2.550 in Dendriten und / oder Axonen lokalisiert sind. Mit Hilfe einer fluoreszierenden Strichcode-Strategie, um einzelne mRNAs zu bezeichnen, zeigen wir, dass ihre relative Häufigkeit in der Neuropil über fünf Größenordnungen variert. Hochauflösende in-situ Hybridisierung Bestätigt die Anwesenheit von mRNAs sowohl in gezüchteten Neuronen als auch in Schnitten des Hippocampus. Unter den vielen identifizierten mRNAs, beobachteten wir einen großen Teil der bekannten synaptischen Proteinen, einschließlich Signalmoleküle, Gerüste und Rezeptoren. Diese Ergebnisse zeigen ein bisher unbeachtet enormes Potenzial der lokalen Proteinsynthesemaschinerie, das dendritische und synaptische Proteom zu versorgen, pflegen und ändern. Basierend auf den Fortschritten der Experimenten in Vorbereitung der nächsten Generation Sequenzierung beobachten wir die Vielfalt der 3’ UTR-Isoformen, die in lokalisierten Transkripten von dem Ratten-Hippocampus vorhanden sind. Unsere Ergebnisse bestätigen eine Zunahme der Heterogenität und 3’UTR Länge in neuronalem Gewebe. Wir untersuchen die evolutionäre Bedeutung der 3’ UTR-Vielfalt und korrelieren diese mit Änderungen in der Arten, Gewebe- und Zell-Komplexität. Die durchgeführte Analyse offenbart sowohl den Bestand der 3’ UTR-Isoformen, der für die Transkript-Lokalisierung in dem gesamten neuronalen Transkriptom erforderlich ist, als auch die regulatorischen Elemente und Bindungsstellen, die für neuronale Abteile spezifisch sind. Die Konfiguration der Poly(A)-Signalen wird mit Genefunktion korreliert und kann weiterhin nach ähnlichen Mechanismen für alternative Polyadenylierung untersucht werden. Die Verwendung von speziell angefertigten Methoden für Next-Generation-Sequenzierung sowie das neuartige Vorgehen zur RNA-Quantifizierung und Visualisierung erfordern die Entwicklung und Umsetzung von neuen nachgeschalteten Analyseverfahren. Wir bieten Bibliotheksmethoden für Annotation, Expression und Ontologierelation von Data-Mining-Transkripten. Wir schlagen die Nutzung einer spezialisierten Suchmaschine vor, die auf die wichtigsten Features von früheren Experimenten abzielt. Durch die Definition experimenteller Qualität und Nutzung von Methoden für die Datennormalisierung entwickeln wir eine Verarbeitungspipeline für Nanostring-Technologie. Hochauflösende in-situ Bilder, die durch eine spezialisierte Anwendung analysiert werden, zeigen eine Korrelation zwischen RNA-Menge und der räumlichen Verteilung. Die große Vielfalt von Bioinformatikmethoden, die in dieser Arbeit enthalten sind, betonnt die Bedeutung der Downstream-Analyse um biologische Schlussvolgerungen zu erzielen. Die Aufrechterhaltung der Integrierbarkeit und Modularität unserer Implementierungen ist von gorßer Priorität, da die dynamische Natur der experimentellen Techniken eine ständige Verbesserung der Computeranalyse erfordert..

Visualization of newly synthesized neuronal RNA in vitro and in vivo using click-chemistry

The neuronal transcriptome changes dynamically to adapt to stimuli from the extracellular and intracellular environment. In this study, we adapted for the first time a click chemistry technique to label the newly synthesized RNA in cultured hippocampal neurons and intact larval zebrafish brain. Ethynyl uridine (EU) was incorporated into neuronal RNA in a time- and concentration-dependent manner. Newly synthesized RNA granules observed throughout the dendrites were colocalized with mRNA and rRNA markers. In zebrafish larvae, the application of EU to the swim water resulted in uptake and labeling throughout the brain. Using a GABA receptor antagonist, PTZ (pentylenetetrazol), to elevate neuronal activity, we demonstrate that newly transcribed RNA signal increased in specific regions involved in neurogenesis