A novel adenovirus vector for easy cloning in the E3 region downstream of the CMV promoter

The construction of expression vectors derived from the human adenovirus type 5 (Ad5), usually based on homologous recombination, is time consuming as a shuttle plasmid has to be selected before recombination with the viral genome. Here, we describe a method allowing direct cloning of a transgene in the E3 region of the Ad5 genome already containing the immediate early CMV promoter upstream of three unique restriction sites. This allowed the construction of recombinant adenoviral genomes in just one step, reducing considerably the time of selection and, of course, production of the corresponding vectors. Using this vector, we produced recombinant adenoviruses, each giving high-level expression of the transgene in the transduced cells

Proteasomal Degradation of p53 by Human Papillomavirus E6 Oncoprotein Relies on the Structural Integrity of p53 Core Domain

The E6 oncoprotein produced by high-risk mucosal HPV stimulates ubiquitinylation and proteasome-dependent degradation of the tumour suppressor p53 via formation of a trimeric complex comprising E6, p53, and E6-AP. p53 is also degraded by its main cellular regulator MDM2. The main binding site of p53 to MDM2 is situated in the natively unfolded N-terminal region of p53. By contrast, the regions of p53 implicated in the degradation by viral E6 are not fully identified to date. Here we generated a series of mutations (Y103G, Y107G, T155A, T155V, T155D, L264A, L265A) targeting the central folded core domain of p53 within a region opposite to its DNA-binding site. We analysed by in vitro and in vivo assays the impact of these mutations on p53 degradation mediated by viral E6 oncoprotein. Whereas all mutants remained susceptible to MDM2-mediated degradation, several of them (Y103G, Y107G, T155D, L265A) became resistant to E6-mediated degradation, confirming previous works that pointed to the core domain as an essential region for the degradation of p53. In parallel, we systematically checked the impact of the mutations on the transactivation activity of p53 as well as on the conformation of p53, analysed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR), circular dichroism (CD), and antibody probing. These measurements suggested that the conformational integrity of the core domain is an essential parameter for the degradation of p53 by E6, while it is not essential for the degradation of p53 by MDM2. Thus, the intracellular stability of a protein may or may not rely on its biophysical stability depending on the degradation pathway taken into consideration

Etude des activités oncogéniques de la protéine HPV16E6 (dégradation de la protéine p53 et interaction avec les protéines à domaines PDZ)

L infection par les papillomavirus humains de haut-risque est le facteur étiologique majeur du cancer cervical. L oncoprotéine E6 des HPVs contribue à la cancérogenèse en partie par son activité de dégradation de la protéine p53, permettant l'inhibition de l'apoptose. Cette activité nécessite la formation d'un complexe entre les protéines E6, p53 et l'ubiquitine ligase E6AP. Ceci induit la polyubiquitination de p53 et sa dégradation par le protéasome 26S. Une autre activité de E6 correspond à sa capacité d interagir avec certaines protéines à domaine PDZ. Cette interaction est liée à la présence d'un motif de liaison au domaine PDZ situé à l'extrémité C-ter de E6 des HPV muqueux de haut-risque. Les protéines à domaine PDZ sont impliquées dans divers processus cellulaires tels que le contrôle de la polarité, l adhésion et la prolifération cellulaire.Cette thèse est centrée sur: 1/l analyse d un mutant de l oncoprotéine E6 agissant en dominant-négatif pour la dégradation de p53 dans les cellules HPV-positives. Le mutant E6 F47R forme un complexe avec p53 et E6AP inactif pour l ubiquitination de p53. L'expression de ce mutant dans les cellules HeLa, bloque leur prolifération et induit leur sénescence prématurée dépendante de p53. 2/l'identification de déterminants structuraux de l'interaction entre HPV16 E6 et le domaine PDZ1 de MAGI-1: les résidus situés en amont du motif de liaison au domaine PDZ, interviennent dans l'interaction avec le domaine. La lysine K499 et la boucle BC du domaine sont impliquées dans l'interaction avec E6. L approche utilisée peut s appliquer aux PDZ ciblés par E6, permettant ainsi d'établir les règles structurales communes aux interactions E6/PDZ.Infection by high-risk human papillomaviruses is the main etiological factor of cervical cancer. HPV E6 oncoprotein contributes to carcinogenesis in part by its activity of p53 degradation, allowing the apoptosis inhibition. This activity needs the formation of a trimeric complex between E6, p53 and the E6AP ubiquitine ligase which induced polyubiquitination of p53 and its degradation by proteasome 26 S. Another activity of E6 is related to its ability to interact with some PDZ-containing proteins. This interaction is due to the presence of PDZ-binding motif located at the C-terminus extremity of high-risk mucosal HPV E6 protein. PDZ-containing proteins are involved in several cellular processes such the control of cell polarity, adhesion and proliferation.This thesis is focused on: (1) the study of an E6 mutant which is dominant-negatif for the degradation of p53 in HPV-positive cell line (HeLa). E6 F47R mutant has the ability to form a complex with p53 and E6AP. This trimeric complex is not able to induce p53 ubiquitination. The mutant expression in HeLa cells, induce their proliferation inhibition and p53-dependant prematured senescence. (2) identification of structural determinants of specificity interaction between HPV16 E6 and MAGI-1 PDZ1 domain : residus located upstream the PDZ-binding motif are involved in the interaction with PDZ domain. Lysine K499 and BC loop of PDZ domain are implicated in the interaction with E6 protein. By applying the same approach to others PDZ domain which are targeted by E6, it will be possible to unravel common structural rules of E6/PDZ interaction.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Stabilisation de p53 et rôle du kinome humain dans l'oncogenèse HPV

Troisième cause de mortalité par cancer chez la femme, les carcinomes du col utérin sont associés dans 99,7% des cas à une infection de virus du papillome humain (HPV de type 16 et 18 essentiellement). L effet oncogène de ces HPV est principalement provoqué par l intégration des gènes codant deux oncoprotéines virales, E6 et E7, dans le génome de la cellule infectée. L inhibition spécifique de l oncoprotéine E6 constitue un enjeu thérapeutique majeur. En effet, l inhibition de E6 provoque la restauration de la protéine p53 et induit l orientation des cellules cancéreuses vers la sénescence ou l apoptose. Cependant, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une bonne compréhension des mécanismes de carcinogenèse afin de découvrir de nouvelles cibles potentielles et de permettre l élaboration de stratégies efficaces. C est dans ce contexte scientifique que s est inscrit mon projet de thèse portant sur la dissection des mécanismes moléculaires de dégradation de la protéine p53 par E6. Pour cela nous avons articulé nos travaux autour de deux axes de recherches: (i) déterminer les résidus de p53 impliqués dans le site de fixation avec les E6 à "haut risque", responsables de la dégradation de p53; (ii) identifier les kinases ayant un rôle sur la dégradation de p53 dans des cellules transformées par HPV.Ce travail a permis de démontrer l importance de la conformation du domaine central de p53 dans la liaison avec E6, par des études portant sur les relations structure/fonction de mutants de p53. De plus, nous avons mis en évidence le rôle de la pseudo-kinase NRBP1 dans la régulation de p53 au sein des cellules transformées par HPV, via la voie NF- B.Third leading cause of cancer death in women, cervical carcinomas are associated in 99.7% of cases with infection of human papillomavirus (HPV types 16 and 18 mostly). The oncogenic effect of these HPV is mainly caused by the integration of genes encoding two viral oncoproteins, E6 and E7 into the genome of infected cells. Specific inhibition of the E6 oncoprotein is a major therapeutic challenge. Indeed, inhibition of E6 leads to a restoration of p53 protein and induces the orientation of the cancer cells to senescence or apoptosis. However, the development of new therapeutic strategies requires an understanding of the carcinogenesis mechanisms in order to discover new targets and enable the development of effective strategies. It is within this scientific context that I entered my thesis project based on the molecular mechanisms dissection of the p53 protein degradation mediated by E6. For that, we articulated our work around two lines of research: (i) determination of the residues of p53 involved in the binding site with E6 of "high risk" HPV, responsible for the degradation of p53; (ii) identification of kinases involve in the p53 degradation in HPV transformed cells. This work demonstrated the importance of the conformation of the p53 core domain in the binding with the oncoprotein E6, by the structure / function studies of mutant p53. In addition, we have highlighted the role of the pseudo-kinase NRBP1 in the regulation of p53 in HPV transformed cells, via the NF-kB pathway.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Cancer du col de l'utérus (Adressage tumoral et définition de ligands peptidiques de l'oncoprotéine E6 de HPV16)

Ces 20 dernières années, l importance des virus du papillome humain (HPV) dit de "haut risque" dans le développement du cancer a été bien documentée, en particulier dans le cancer du col de l'utérus. Les deux oncoprotéines virales E6 et E7 participent à de nombreux processus cellulaires conduissant à l'immortalisation des cellules. En particulier, le processus de degradation de p53 médié par E6/E6-AP n'est pas connu dans le détail. Le décryptage du mécanisme moléculaire de l interaction de E6 de HPV de haut risque avec ses partenaires cellulaires fournira à terme des donnés indispensables dans la compréhension du processus d immortalisation et le développent d inhibiteurs spécifiques et efficaces. L élaboration de stratégies de ciblages aidera aussi bien le diagnostic que le traitement efficace des tumeurs. L objectif de mon travail de doctorat est articulé autour de deux axes. Le premier a eu trait a la sélection par phage display de peptides ciblant spécifiquement des cellules issues de tumeurs du col de l utérus. Ces peptides ont été ensuite utilisés pour re-diriger la toxine diphtérique spécifiquement au niveau de cellules SiHa, lignée cellulaire issue d un carcinome cervical humain. Le deuxième axe a concerné la définition par phage display de plusieurs familles de ligands peptidiques de E6 de HPV 16. Une des familles de peptides présente une homologie significative avec une région de p53. L étude approfondie in vitro et sur cellules en culture de mutants de p53 dans cette région a révélé son importance dans la dégradation de p53 par E6.In the last 20 years the importance of "high-risk" human papilloma viruses (HPVs) in the development of cancer has been well documented, particularly in the development of cervical cancer. The two viral oncoproteins E6 and E7 participate in a number of cellular processes leading to the immortalization of infected cells. In particular, the process of p53 degradation mediated by E6/E6-AP has yet to be fully elucidated. The understanding of the molecular interaction of "high-risk" HPV E6 with its cellular partners will provide important information for the understanding of cellular immortalization and for the development of specific inhibitors. Furthermore, the conception of targeting strategies will be beneficial for both the diagnosis and treatment of tumours. The first axe of my work concerned the selection, by phage display, of peptides specifically targeting cells derived from cervical tumours. These peptides were used to redirect the diphtheria toxin to SiHa cells, a cell line derived from a human cervical carcinoma. The second axis concerned the definition by phage display of several groups of peptide ligands of the HPV 16 E6 oncoprotein. One of these groups of peptides presented significant homology with a region of p53. The study in vitro as well as on cultured cells of the p53 protein mutated in this region revealed its importance in the degradation of p53 by E6.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Etude de la protéine ARFP/Core+1/S du virus de l'hépatite C (Analyse du mécanisme de la traduction, caractérisation biophysique et étude fonctionnelle)

Le virus de l hépatite C (VHC) touche plus de 170 millions d individus dans le monde. Aucun vaccin n est encore disponible et les thérapies actuelles sont insuffisantes en raison de la variation génomique et de son extrême résistance. Le VHC produit 11 protéines structurales et non structurales qui participent à la formation et la production de virions infectieux ainsi qu à la persistance au sein de la cellule. Ces protéines sont impliquées dans l établissement de graves pathologies tels que la cirrhose et l hépatocarcinome, 3ème cause de décès par cancer dans le monde. En outre, le VHC possède un cadre de lecture ouvert alternatif qui chevauche celui codant la protéine de la capside (Core) avec un décalage d une base (+1), nommé cadre de lecture Core+1. Un groupe de protéines nommées ARFP/Core+1 sont traduites à partir de ce cadre à la suite de phénomènes inhabituels comme le décalage de lecture ribosomique ou l initiation interne à des codons alternatifs. Des études antérieures consacrées au cadre Core+1 du VHC-1a ont montré que la protéine ARFP/Core+1/S est la forme majoritairement exprimée à partir de ce cadre. Nous avons initié les études sur la protéine ARFP/Core+1/S du VHC-1b qui est associée au carcinome hépatocellulaire en comparaison avec l isoforme du VHC-1a. Cette étude a compris trois volets : (1) l étude de la traduction des protéines ARFP/Core+1 du VHC-1b, (2) la caractérisation structurale de la protéine ARFP/Core+1/S et (3) l étude fonctionnelle de cette protéine. Notre travail apporte de nouveaux éléments qui contribuent à la caractérisation de la protéine ARFP/Core+1/S et à la compréhension de son rôle au sein de l infection et de la pathogenèse du VHC.The hepatitis C virus (HCV) infects more than 170 million people in the world. To date, no vaccine is yet available and current therapies are limited due to the extreme genetic heterogeneity of the virus and its constant resistance. The HCV produces a polyprotein, which is processed to give rise to 11 structural and non structural proteins involved in the structure, the replication and the persistance of the virus. These proteins are also known to causes severe pathologies including cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), the third death-causing cancer worldwide. In addition, the HCV genome contains an alternative reading frame known as Core+1 ORF, which overlaps the capsid protein (Core) gene with a shift of one base (+1). This frame was shown to express a group of proteins named ARFP/Core+1 through unusual events such as ribosomal frameshift or internal initiation at alternative codons. Extensive studies of the HCV-1a Core+1 ORF previously showed that ARFP/Core+1 is the major form expressed from this frame. We sought to study the ARFP/Core+1/S proteins of HCV-1b associated to HCC. Our study was divided into the 3 following parts: (1) unravelling the mechanism involved in the translation of the ARFP/Core+1 proteins of the VHC-1b, (2) dissecting the structural features of the ARFP/Core+1/S and (3) understanding the functional role of this protein. This work provides new insights into the characterization of the ARFP/Core+1/S protein and contributes to understanding the role of this protein in the HCV infection course and pathogenesis.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceGreeceFRG

Intracellular scFvs against the viral E6 oncoprotein provoke apoptosis in human papillomavirus-positive cancer cells.

The E6 protein of human papillomavirus type 16 (16E6) is involved in the tumorigenesis of human cervical cells by targeting numerous cellular proteins. We have designed a strategy for neutralizing 16E6 based on the intracellular expression of single-chain Fv antibodies (scFvs) specific to 16E6. Recombinant adenovirus vectors were constructed to allow expression of two 16E6-binding scFvs and one 16E6-non-binding scFv in HPV16-positive and -negative cells. Expression of the scFvs provoked two types of effects: (i) inhibition of proliferation of all cell lines tested, this aspecific toxicity being likely due to the aggregation of unfolded scFvs; and (ii) apoptosis observed only in HPV16-positive cervical cancer cell lines after expression of 16E6-binding scFvs, this specific effect being proportional to the intracellular solubility of the scFvs. These data demonstrate the feasibility of intracellular immunization with anti-16E6 scFvs and highlight the importance of the solubility of the intracellular antibodies

Comparative properties of two peptide-antibody interactions as deduced from epitope delineation.

The linear epitope recognized by three closely related antibodies specific for the E6 oncoprotein of papillomavirus type 16 was delineated by phage display, spot peptide synthesis on cellulose membranes, and kinetic measurements with antigenic variants using a BIACORE. The same approaches, recently applied to an antibody specific for tobacco mosaic virus protein, led to the clear-cut delineation of a functional epitope comprising four key positions with well defined physico-chemical properties. In contrast, the E6 system is characterized by a non-essential contribution to binding of various factors, so that combinations of alternative properties are compatible with measurable binding activity

Prevalence of intrinsic disorder in the hepatitis C virus ARFP/Core+1/S protein

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