Charakterisierung der Ratten-Makrophagenzellinien R2 und NR8383 und Untersuchung des Einflusses ausgewählter mineralischer Fasern und Partikel auf die Freisetzung immunologisch wirksamer Substanzen

Zusammenfassung Mineralische Fasern finden seit Jahren weltweiten Einsatz als Ersatzstoffe für Asbest, dessen biologische Potenz in der Induktion von Asbestose und Neoplasien hinreichend bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluß solcher Ersatzmaterialien wie Titandioxid, Keramikfasern, Glaswolle und Steinwolle auf Makrophagen und deren Reaktion auf diesen Reiz zu beschreiben, zu analysieren und somit möglichst eine Aussage über die Pathogenität der eingesetzten Materialien treffen zu können.Untersucht wurde der Einfluß der Materialien auf die Vitalität der Zellen und die Induktion von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-alpha, IL-1beta, MCP-1, sowie die Bildung von NO durch Makrophagen. In meiner Arbeit wurden die Pleuramakrophagenzellinie R2 sowie Alveolarmakrophagenzellinie NR8383 der Ratte eingesetzt. Um herauszufinden, ob die Zellinien für die folgenden Untersuchungen geeignet waren, erfolgte zunächst deren Charakterisierung. Hierfür wurden die Zellinien mittels LPS und IFN-gamma in verschiedenen Konzentrationen stimuliert. LPS war in der Lage, beide Zellinien zu einer gesteigerten dosisabhängigen Produktion von NO, TNF-alpha, MCP-1 sowie IL-1 beta anzuregen. IFN-gamma, als endogener Stimulus, hatte allein kaum Einflüsse auf die Expression dieser Mediatoren. In der Kostimulation erfolgte aber für die Bildung von NO eine überadditive Steigerung der LPS-induzierten Freisetzung. TNF-alpha, MCP-1 und IL-1 beta wurden durch geringe Konzentrationen von IFN-gamma (1 U/ml) nach Gabe von LPS noch verstärkt freigesetzt.Unter Berücksichtigung der Literatur weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß sowohl die Alveolarmakrophagenzellinie NR8383 als auch die Pleuramakrophagenzellinie R2 typische Eigenschaften von primären Makrophagen aufwiesen und somit für die Experimente geeignet waren. Nach 24-stündiger Stimulation der Makrophagenzellinen mit den eingesetzten Fasern und Partikeln in den Konzentrationen 2, 10 und 50 mikrogramm/cm2 wurde die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen untersucht. Als Positivkontrolle kamen Christobalit sowie Chrysotil zum Einsatz. Die Ergebnisse zeigten vor allem für Titandioxid eine besondere biologische Reaktivität auf. In der Mikroskopie konnte jedoch gezeigt werden, dass die eingesetzten Fasern und Partikel sich in den Dimensionen Länge, Breite und Masse maßgeblich unterschieden. Die Anzahl der Zell Faser- und Partikelinteraktionen war somit sehr unterschiedlich. Um zu vergleichbaren Ergebnissen zu gelangen, wurde in nachfolgenden Untersuchungen im Gegensatz zur Masse/cm2, der Einfluß der Anzahl der phagozytierbaren Fasern und Partikel auf die Makrophagenzellinen untersucht. Wurden die Zellinien mit der gleichen Menge an phagozytierbaren Einheiten (pE) mit und ohne IFN-gamma als Zusatz stimuliert, führten alle verwendeten Fasern zu einer Bildung von NO. Alle Fasern und Partikel außer Titandioxid konnten TNF-alpha in den Makrophagenzellinien induzieren. Bis auf Titandioxid und Glaswolle stimulierten die restlichen mineralischen Stoffe die Zellinien zur Freisetzung von MCP-1. Ein besonderes Problem von in vitro Studien mit Zellinien stellt die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf primäre Zellen dar. Um zusätzlich auch Speziessunterschiede abzubilden, wurden die Untersuchungen in gleicher Weise an humanen Monozyten durchgeführt, die aus dem „buffy-coat“ von Blutspendern gewonnen wurden. Die Monozyten reagierten auf die Applikation von Titandioxid, Christobalit und Asbest in der Kombination mit IFN-gamma mit einer gesteigerten Synthese von MCP-1. Da sich die Reaktionen der Makrophagenzellinen von denen der humanen Monozyten unterschieden, werden hier speziesspezifische und auch gewebespezifische Unterschiede diskutiert. Letzteres wird auch durch die unterschiedliche Reaktion der Pleuramakrophagenzellinie und der Alveolarmakrophagenzellinie nach Inkubation mit den Faserpräparationen unterstrichen. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß alle eingesetzten Fasern und Partikel in der Lage waren, eine proinflammatorische Reaktion in Makrophagen und Monozyten hervorzurufen. Prinzipiell stehen somit alle eingesetzten Materialien unter dem Verdacht, eine Pneumokoniose induzieren zu können. Um genauere Vorhersagen über das pathogene Potential der Materialien machen zu können, ist neben der biologischen Reaktivität, die in unserem Testsystem nachgewiesen wurde, die Dauer der Biopersistenz der Materialien von besonderer Bedeutung. Sie setzt sich aus der Clearance der Fasern und Partikel, deren Translokationsrate in das Interstitium und deren Löslichkeit in der Lunge zusammen. Um die Biopersistenz zu ermitteln, sind in vivo Untersuchungen notwendig. Der in unseren Untersuchungen entwickelte Testansatz könnte in Zukunft die Frage der biologischen Reaktivität von MMVF beantworten und in der Zusammenschau mit der Biopersistenz eine Vorhersage über das pathogenen Potential der eingesetzten Materialien erlauben

Polymorphismusanalyse von vier MHC Klasse I Genen im Hund

Die vier bekannten strukturell komplette MHC Klasse I Gene im Hund wurden auf ihre Polymorophismen hin untersucht. DLA-88, -79, -12 und -64 zeigten unterschiedlich viele Variationen in Hinblick auf die Gensequenzen. Es wurden in der Analyse die ersten drei Exons sequenziert, da diese auch beim Menschen und anderen Spezies die häufigsten Polymorphismen aufweisen. Es wurde die DNA aus peripherem Blut gewonnen, durch PCR die entsprechenden Genabschnitte amplifiziert, diese kloniert und dann sequenziert. Dabei zeigte sich, dass DLA-88 die meisten Allele zeigte. Bei 63 Hunden wurden 44 Allele gefunden. Bei den übrigen Genen fanden sich nur 2-4 Allele. Daher wurde postuliert, dass es sich bei DLA-88 um ein klassisches MHC Klasse Ia Gen handelt. Aus den Ergebnissen dieser Studie wurde inzwischen ein Typisierungssystem entwickelt, welches bei der Suche nach geeigneten Spendern und Empfängern für Knochenmark- bzw. Stammzelltransplantationen eingesetzt wird

Die Induktion von CCL3, IRF-1, IRF-7 und IL-24 durch Influenza A Virus-Infektion von Monozyten und die Bedeutung eines essentiellen Abschnittes im CCL3-Promotor

Im Verlauf einer Infektion mit dem Influenza-Virus A/PR/8 werden nicht nur respiratorische Epithelien, sondern auch Monozyten und Makrophagen infiziert. Obwohl diese für die Replikation des Virus nur eine untergeordnete Rolle spielen, sind sie für die Koordination und Verstärkung der Immunantwort des Körpers auf die Infektion wichtig. Diese Funktionen an der Schnittstelle zwischen angeborener und erworbener Immunität üben Monozyten/Makrophagen u.a. über die Sekretion regulatorischer Moleküle wie z.B. Zytokine und Chemokine aus. Auch bei der Infektion primärer Monozyten mit Influenza A-Viren kommt es zur Freisetzung einer Vielzahl von Zytokinen und Chemokinen, wie z.B. CCL3 (MIP-1α). CCL3 und seine Rezeptoren CCR2 und CCR5 regulieren die Immunantwort bei einer Influenza A-Virusinfektion durch die Rekrutierung mononukleärer Zellen und die Verstärkung bzw. Aktivierung anderer Immunzellen, u.a. auch der T-Zellen. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der Induktion von CCL3 durch Influenza A/PR/8 in Monozyten untersucht. Im CCL3-Promotor wurde ein Abschnitt identifiziert, der essentiell ist für eine Induktion von CCL3 durch die Infektion mit Influenza A/PR/8 oder durch eine Stimulation mit LPS. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden potentiellen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren innerhalb dieses regulatorischen DNA-Abschnittes (MNP und ICK) synergistisch wirken, d.h. nur zusammen eine maximale Induktion von CCL3 als Antwort auf den entsprechenden Stimulus möglich ist. Dies gilt sowohl für die Influenza A-Infektion als auch für die LPS-Stimulation. Es gibt starke Hinweise dafür, dass an einer dieser beiden Bindungsstellen, MNP, der Transkriptionsfaktor C/EBPβ bindet; der oder die bindenden Faktoren an der ICK-Stelle konnten bisher nicht identifiziert werden. Die Tatsache, dass sowohl eine Influenza A-Infektion als auch eine Stimulation mit LPS das Chemokin CCL3 über die beiden Bindungsstellen MNP und ICK induzieren kann, spricht für eine Aktivierung der dort bindenden Faktoren im Rahmen einer Kernantwort (core response), die als Reaktion auf verschiedene Stimuli vorkommt und stellt damit auch ein interessantes Ziel zu einer möglichen Intervention dar. Zu den Transkriptionsfaktoren, die eine Aktivierung des Immunsystems sowohl bei viralen als auch bei bakteriellen Infektionen vermitteln, gehören auch die Mitglieder der Interferon regulatory factor (IRF)-Familie. Diese können durch intrazelluläre Signalwege aktiviert oder neu induziert werden und regulieren u.a. ihrerseits die Induktion von Zytokinen und Chemokinen wie IL-12 und CCL5. In dieser Arbeit wurde deshalb auch die Induktion der Transkriptionsfaktoren IRF-1 und IRF-7 im Rahmen einer Influenza A-Virusinfektion untersucht. Für beide Faktoren konnte eine Induktion auf mRNA-Ebene und eine de novo-Proteinsynthese gezeigt werden. Dies unterstreicht die zentrale Rolle, die diese Faktoren bei der Aktivierung des Immunsystems als Antwort auf extra- und intrazelluläre Pathogene haben. Interleukin-24 (IL-24) ist ein erst 1996 neu entdecktes Zytokin, das Homologien zu IL-10 aufweist und bisher vor allem wegen seiner anti-proliferativen Wirkung auf Tumorzellen untersucht worden ist. Obwohl es funktionell andere Eigenschaften als IL-10 aufweist, konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-24 auch durch eine Influenza A-Virusinfektion in primären Monozyten auf mRNA-Ebene induzierbar ist. Die genaue Wirkung von IL-24 im Rahmen einer viralen Infektion ist noch nicht aufgeklärt. Es gibt jedoch Hinweise, dass IL-24 eine Aktivierung der intrazellulären Proteinkinase PKR vermitteln kann, die bei viralen Infektionen eine wichtige Rolle spielt. Weitere Mechanismen der Aktivierung des Immunsystems durch IL-24 im Rahmen von viralen Infektionen sind noch zu erforschen

Depletion und Suppression humaner HLA-alloreaktiver T-Zellen durch CD95L-exprimierende Zellen

In dieser Arbeit wurde die Depletion alloreaktiver T-Zellen mittels CD95L exprimierender Zellen mit dem Ziel einer möglichen Anwendung von Donor-Lymphozyten-Präparaten nach allogener Stammzelltransplantation (SCT) untersucht. Die Infusion von Donor-Lymphozyten soll vor allem nach haploidenter SCT, bei der hochaufgereinigte Stammzellen verabreicht werden, die benötigte Zeit der Immunrekonstitution verkürzen. Dem Ansatz, CD95L exprimierende Zellen zur Allodepletion zu verwenden, lag die Tatsache zugrunde, dass vor allem aktivierte T-Zellen sensitiv für CD95L-vermittelte Apoptose wurden, während nicht aktivierte T-Zellen eher eine Resistenz gegenüber CD95L aufwiesen. Unter Anwendung gemischter Lymphozytenkulturen zur allogenen Stimulation wurde untersucht, ob CD95L exprimierende Zellen in diesen Kultursystemen effizient Apoptose induzieren können. Dafür erfolgte die Apoptoseinduktion durch lentiviral CD95L transduzierte B-Zell-Linien oder Fibroblasten entweder simultan zur – oder sequentiell nach – allogener Aktivierung der T-Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl allospezifische Proliferation als auch Zytotoxizität nach simultaner Aktivierung und Apoptoseinduktion durch die CD95L exprimierende B-Zell-Linie C1R-A1-CD95L vollständig inhibiert waren. Da diese Zell-Linie ausschließlich HLA-A1 spezifisch stimuliert – und Apoptose induziert, wurde hierdurch zwar die Effektivität der Apoptoseinduktion demonstriert, ohne jedoch klinisch praktikabel zu sein. Im nächsten Schritt wurde für eine potentielle klinische Anwendung ein sequentielles Kultursystem entwickelt, in dem eine EBV-transformierte B-Zell-Linie zur allogenen Stimulation verwendet und nachfolgend Apoptose durch CD95L-exprimierende Zellen induziert wurde. Auch in diesem System zeigten wir eine effektive Inhibition der Immunantwort: in vitro war keine residuale Alloreaktivität mehr nachweisbar. Der Vorteil des sequentiellen Kultursystems liegt in der universellen Einsetzbarkeit einer CD95L-exprimierenden Zell-Linie für die Depletion individueller, HLA-spezifisch stimulierter T-Zellen. Da CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) für die Unterdrückung alloreaktiver Immunreaktionen und GvHD (Graft-versus-host-disease) nach SCT von großer Bedeutung sind, wurde außerdem deren Präsenz und Funktion nach erfolgter Apoptoseinduktion analysiert. Sowohl im simultanen als auch im sequentiellen Kultursystem blieben funktionelle CD4+CD25+FoxP3+ Treg erhalten. Treg, die hier durch eine mäßiggradige CD25 Expression charakterisiert waren, erwiesen sich als resistent gegenüber CD95L vermittelter Apoptose und wurden in den Kulturen mit C1R-A1-CD95L sogar angereichert. Interessanterweise ging die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3, welcher für die Funktion von Treg essentiell ist, nicht konstant mit einer suppressorischen Wirkung einher. Erstmalig wurde Funktion und FoxP3-Expression nach Apoptoseinduktion untersucht und somit sichergestellt, dass es sich bei der residualen CD4+CD25+ Population tatsächlich um regulatorische T-Zellen handelte. Außerdem deuten unsere Ergebnisse auf eine antigenspezifische Funktion der erhaltenen Treg, was für eine klinische Anwendung von Bedeutung ist, da sonst das Risiko einer generellen Immunsuppression bestünde. Im Rahmen der Dissertation wurde eine Methode zur Depletion alloreaktiver T-Zellen mittels CD95L exprimierender B-Zell-Linien entwickelt, ohne dass regulatorische T-Zellen von der Apoptoseinduktion betroffen waren. Die Kombination aus selektiver Apoptoseinduktion allogen stimulierter T-Zellen und Suppression residualer Alloreaktivität durch Treg führte zu einer maximalen Effektivität des Systems und eröffnet vielversprechende Möglichkeiten für eine therapeutische Nutzung