The use of CRISPR-Cas9 system for MMP-9 silencing in the treatment of bladder cancer

INTRODUÇÃO: O Câncer de Bexiga (CaB) é o décimo tipo de câncer mais comum entre ambos os sexos, responsável por cerca de 4% de todos os casos novos de câncer. É uma doença de morbidade, mortalidade e custos significativos, principalmente nos casos de estadiamento mais avançados. Com o avanço da pesquisa básica em oncologia, novos marcadores tumorais e mecanismos de evolução da doença têm surgido. Com o advento da técnica de CRISPR-Cas9 para edição genômica, novas perspectivas surgiram no estudo do processo de surgimento e progressão do câncer, como a análise do papel de moléculas específicas no processo de carcinogênese, como a metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9). OBJETIVO: Analisar o efeito do bloqueio da expressão gênica da MMP-9 utilizando a técnica de CRISPR-Cas9 para edição gênica em células de carcinoma urotelial de bexiga T24-luc. MÉTODOS: Inicialmente, foi realizada a inserção das sequências de RNAs guias (sgRNA 1 e 2) para sequências-alvo no gene da MMP-9 no plasmídeo pX-330. Em seguida, os plasmídeos já modificados foram transfectados em linhagens celulares T24-luc e posteriormente, realizadas análises de expressão gênica e proteica por meio de RT-qPCR e Western-blotting, respectivamente. Para a análise do impacto funcional do bloqueio da MMP-9, foram realizados ensaios de proliferação celular e apoptose com citometria de fluxo, ensaio de formação de colônias, ensaio de migração celular por meio do teste de fechamento de ferida e ensaio de invasão celular através da técnica de Matrigel. RESULTADOS: Primeiramente, foi realizada a validação dos plasmídeos pX-330 após inserção dos sgRNAs da MMP-9 por meio de sequenciamento. Após a transfecção da linhagem celular T24, comprovada pela presença de GFP positiva na microscopia de fluorescência, observou-se a redução da expressão gênica de MMP-9 utilizando a sgRNA2 e redução da expressão proteica de MMP-9 com ambos sgRNAs. O efeito celular do knockout da MMP-9 foi observado por redução da capacidade de proliferação e aumento da apoptose celular em citometria de fluxo e redução da capacidade de formação de colônias in vitro, das células editadas em comparação ao controle. Observou-se, ainda, significativa redução na capacidade de migração e de invasão celular de células transfectadas.CONCLUSÃO: A edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9 para o silenciamento da MMP-9 em linhagem celular de CaB foi capaz de inibir funções como proliferação, migração e invasão celular, etapas essenciais no processo de progressão tumoral, bem como estimulou a apoptose das células editadas. Tais resultados não só corroboram com o papel da MMP-9 nos processos de tumorigênese como também sugerem a MMP-9 como possível alvo terapêuticoINTRODUCTION: Bladder Cancer (BCa) is the tenth most common type of cancer among both sexes, responsible for approximately 4% of all new cancer cases. It is a disease of significant morbidity, mortality, and healthcare costs, especially in more advanced cases. With the advancement of basic cancer research, new biomarkers and disease mechanisms have emerged. The arrival of the CRISPR-Cas9 genome editing technique brought new perspectives for basic oncologic research, such as the analysis of the role of specific molecules in the carcinogenesis process, such as matrix metalloproteinase 9 (MMP-9). OBJECTIVE: To analyze the MMP-9 gene expression downregulation effects by CRISPR-Cas9 genome editing technique in T24-luc bladder urothelial carcinoma cell lines. METHODS: Initially, the insertion of guide RNA sequences (sgRNA 1 and 2) for target sequences in the MMP-9 gene in the pX-330 plasmid was performed. Then, the modified plasmids were transfected into T24-luc cell lines, and gene and protein expression were analyzed using RT-qPCR and Westernblotting, respectively. To analyze the functional impact of MMP-9 silencing, cell proliferation and apoptosis assays were performed using flow cytometry, colony formation assay, cell migration assay using the wound healing test, and Matrigel cell invasion assay. RESULTS: Firstly, sequencing validated the pX-330 plasmids after insertion of the MMP-9 sgRNAs. After transfecting the T24 cell line, proven by the presence of positive GFP in fluorescence microscopy, a reduction in MMP-9 gene expression was observed using sgRNA2, and a reduction in MMP-9 protein expression was observed with both sgRNAs. The effect of MMP-9 knockout on T24 cells was observed by reduced proliferation capacity, increased cellular apoptosis in flow cytometry, and reduced in vitro colony formation capacity of edited cells compared to the control. A significant reduction in transfected cells\' migration and invasion capacity was also observed. CONCLUSION: The CRISPR-Cas9 gene editing technique for silencing MMP-9 in BCa cell lines inhibited functions such as proliferation, migration, and cell invasion, essential steps in the tumor progression process, and increased apoptosis of edited cells. These results support the role of MMP-9 in tumorigenesis processes and suggest MMP-9 as a potential therapeutic targe

Scoring system for prediction of overall survival in patients with renal cell carcinoma T3aN0M0

Abstract Objective We aim to create a new score to predict postoperative overall survival in patients with nonmetastatic T3aN0 renal cell carcinoma. Methods We reviewed the clinical data of adult patients who underwent radical nephrectomy for renal cell carcinoma between December 2007 and January 2022 in a single tertiary oncological institution. Clinical characteristics, clinical‐pathological staging and histopathological characteristics were analysed. Survival analyses were determined using the Kaplan–Meier curve. A nomogram was established using Cox proportional hazard regression to identify the prognostic factors affecting the overall survival. The area under the curve, calibration curves and decision curve analysis were used to evaluate prognostic efficacy. Results We analyzed 362 patients classified as pT3aN0M0 stage with a median follow‐up of 40 months. According to Cox univariate and multivariate analyses, weight loss greater than 5% in 6 months before surgery, stage V chronic kidney disease after radical nephrectomy, sarcomatoid pattern, and coagulative tumor necrosis were identified as predictors of overall survival. We developed a score and performed internal and external validation. The time‐dependent receiver operating characteristic curve, area under the curve value and calibration curve analysis showed good prediction ability of the score. The nomogram can effectively predict and stratify overall survival after radical nephrectomy in patients with pT3aN0M0 renal cell carcinoma. Conclusion Patients with pT3aN0MO renal cell carcinoma exhibited different characteristics, and those with unfavourable characteristics deserve greater attention during follow‐up. This nomogram provides an accurate prediction of overall survival after radical nephrectomy