Nalaz leptospira u nutrije (Myocastor coypus) i štakora selca (Rattus norvegicus) koji nastanjuju zaštićeno močvarno područje u Toskani u Italiji.

From September 2009 to February 2011, 122 coypus (Myocastor coypus) and 74 rats (Rattus norvegicus) were captured employing cage traps in a protected wetland in Tuscany (central Italy). Blood serum samples were collected from the animals and successively examined by the microagglutination test for several serovars of Leptospira: Bratislava, Ballum, Bataviae, Grippothyphosa, Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Mini, Pomona, Zanoni, Sejroe, Hardjo and Tarassovi. Kidney samples were collected from each animal and tested by bacteriological methods and submitted to Polymerase Chain Reaction. Thirty-four (27.87 %) coypu sera were positive to Leptospira interrogans serovar Bratislava, with antibody titers ranging from 1:100 to 1:400; no strain was isolated from coypu by bacteriological examination, while 12 (9.83 %) subjects were positive to PCR. All rats resulted seronegative; thirty-seven (50 %) Leptospira strains were isolated from rat kidneys; 30 were classified as Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae and 7 as Leptospira interrogans serovar Ballum by the cross-agglutination test. Forty-five (60.81 %) rats resulted positive to PCR: 37 subjects positive to bacteriological examination and there were eight from which no strain were isolated from kidneys. These results would seem to suggest the minor zooepidemiological role of coypu in leptospirosis, which is widespread according to literature.Od rujna 2009. do veljače 2011. u zamke su bile uhvaćene 122 nutrije (Myocastor coypus) i 74 štakora selca (Rattus norvegicus) u zaštićenoj močvari u Toskani u središnjoj Italiji. Prikupljeni uzorci krvnog seruma bili su pretraženi mikroaglutinacijskim testom na nekoliko serovarova leptospira: Bratislava, Ballum, Bataviae, Grippothyphosa, Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Mini, Pomona, Zanoni, Sejroe, Hardjo i Tarassovi. Uzorci tkiva bubrega, uzeti od svake životinje, bili su pretraženi bakteriološki i lančanom reakcijom polimerazom. Tridesetčetiri (27,87 %) uzorka seruma nutrije bila su pozitivna na vrstu Leptospira interrogans serovar Bratislava s titrom protutijela od 1:100 do 1:400. Bakteriološkom pretragom iz nutrija nije bio izdvojen nijedan izolat, dok je 12 uzoraka (9,83 %) bilo pozitivno PCR-om. Svi štakori bili su serološki negativni, ali je 37 (50 %) izolata leptospira bilo izdvojeno iz tkiva njihovih bubrega. Od toga je 30 izolata pripadalo vrsti Leptospira interrogans serovaru Icterohaemorrhagiae, a 7 serovaru Ballum pretragom križnim aglutinacijskim testom. Ukupno su 45 štakora (60,81 %) bila pozitivna pretragom PCR-om, a 37 bakteriološkom pretragom. Od osam štakora nije bio izdvojen nijedan izolat leptospira iz bubrega. Ti rezultati upućuju na neznatnu zooepidemiološku ulogu nutrija u širenju leptospiroze

Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cheeses from small ruminants in Tuscany

Paratuberculosis is an infectious disease which affects mainly domestic and wild ruminants caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). Map has been associated with human diseases like Crohn disease, type-1 diabetes, sarcoidosis, multiple sclerosis and Hashimoto's thyroiditis. The aim of this study was to determine the level of Map positivity of cheeses produced in Tuscany (Italy) as an indication of human exposure to the specific pathogen. Sampling was focused on artisanal cheeses produced without commercial starter culture from raw sheep or goat milk, on small-scale farms.Samples were tested by quantitative PCR (qPCR) and culture. Map DNA was detected in 4/7 (57.14%) goat, and in 14/25 (56%) sheep cheeses by qPCR, whereas cultivation produced a positive result in only one case. This corresponded to a goat cheese that had also reacted positively by qPCR and yielded a viable Type S (sheep) strain of Map. The Map load of the tested samples based on qPCR ranged from 6×10 to 1.8×104Map cells/g of cheese. The results indicate on average 56.57% and 66.6% positivity of cheese samples and farms, respectively. Hence, the type of cheeses that were analyzed within the context of this study seem to constitute a considerable source of human exposure to Map; although the question remains of whether the Map cells were present in a viable form, since positive results were almost exclusively recorded by qPCR

Occurrence of Coxiella burnetii in goat and ewe unpasteurized cheeses: Screening and genotyping

Q fever is a zoonosis caused by Coxiella burnetii which infects humans as well as several animal species; sheep, goats and cattle are the primary animal reservoir. The main route of human exposure to Coxiella burnetii is inhalation of contaminated aerosols from excreta, especially birth products, while the role of unpasteurized dairy products in the transmission of Q fever to humans remains still controversial. The aim of this work was to evaluate the presence of Coxiella burnetii in unpasteurized cheese samples (n=84) by PCR and to genotype the circulating strains by Multispacer sequence typing (MST) analysis. Coxiella burnetii DNA was detected in 27/84 (32.14%) cheeses and positivity rate of handicraft cheeses reached 17.24%, while positivity rate of non-handicraft cheeses reached 65.38%. In addition, the MST profile of Coxiella burnetii detected in 5 cheese samples have shown the circulation of ST12 and ST32 genotypes in Tuscany

Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophilus as starter cultures for a donkey milk fermented beverage

Donkey milk is recently gaining attention due to its nutraceutical properties. Its low casein content does not allow caseification, so the production of a fermented milk would represent an alternative way to increase donkey milk shelf life. The aim of this study was to investigate the possibility of employing selected Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum isolates for the production of a novel donkey milk fermented beverage. Lysozyme resistance and the ability to acidify donkey milk were chosen as main selection parameters. Different fermented beverages (C1–C9) were produced, each with a specific combination of isolates, and stored at refrigerated conditions for 35 days. The pH values and viability of the isolates were weekly assessed. In addition, sensory analysis was performed. Both S. thermophilus and L. plantarum showed a high degree of resistance to lysozyme with a Minimum Bactericidal Concentration > 6.4 mg/mL for 100% of S. thermophilus and 96% of L. plantarum. S. thermophilus and L. plantarum showed the ability to acidify donkey milk in 24 h at 37 °C, with an average ΔpH value of 2.91 ± 0.16 and 1.78 ± 0.66, respectively. Four L. plantarum and two S. thermophilus were chosen for the production of fermented milks. Those containing the association S. thermophilus/L. plantarum (C1–C4) reached a pH lower than 4.5 after 18 h of fermentation and showed microbial loads higher than 7.00 log cfu/mL until the end of the storage period. Moreover, comparing the microbial loads of samples containing both species and those containing S. thermophilus alone (C5), we highlighted the ability of L. plantarum to stimulate S. thermophilus replication. This boosted replication of S. thermophilus allowed to reach an appropriate pH in a time frame fitting the production schedule. This was not observed for samples containing a single species (C5–C9). Thus, L. plantarum strains seem to be good candidates in the production of a novel type of fermented milk, not only for their probiotic potential, but also for the enhancing effect on S. thermophilus growth

EFFETTO DELL’ADDIZIONE DI POLLINE D’API BIOLOGICO ESSICCATO SULLO SVILUPPO DI MICRORGANISMI PATOGENI IN LATTE

Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l'effetto dell'addizione di una sospensione di polline d'api biologico essiccato sullo sviluppo in latte di alcuni microrganismi patogeni. Il polline utilizzato è stato raccolto da api allevate in provincia di Lucca (Toscana, Italia) nell’anno di vegetazione 2013 ed è stato utilizzato per preparare una sospensione da addizionare in ragione dell’ 1%, 2%, 4% (v/v) a Skim Milk inoculato con ceppi patogeni di referenza in cariche pari a 106 UFC/mL. I ceppi indagati sono stati Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus aureus ATCC 6539, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enterica sv. Thyphimurium ATCC 14028. Lo sviluppo dei microrganismi è stato monitorato dopo 24 e 48 ore dall’inoculo in campioni mantenuti a temperatura di refrigerazione e a temperatura ottimale di crescita. E’ stato inoltre valutato il profilo microbiologico del polline impiegato. Il polline utilizzato presentava una carica batterica mesofila pari a 4,9 log UFC/g, con cariche in Enterobacteriaceae e Lactobacillus spp. pari a 3,7 log UFC/g e 4,9 log UFC/g, rispettivamente. Muffe e lieviti presentavano una carica di 5,5 log UFC/g. Variazioni nelle conte in latte sono state rilevate solamente dopo incubazione a temperatura ottimale di sviluppo. A 48 h di incubazione E. faecalis in latte al 4% di polline ha mostrato una diminuzione delle cariche pari a 1 log UFC/mL; S. aureus è diminuito di 2 log ufc/ml in latte al 2% e 4% di polline; L. monocytogenes è diminuita di quasi 4 log UFC/mL, sempre in latte al 4% di polline. Infine, S. enterica ha mostrato ben 6 log UFC/mL di diminuzione dopo 48 ore in latte al 4% di polline. Analisi ulteriori sono necessarie al fine di valutare in quale entità le diminuzioni riscontrate siano dovute ai composti antimicrobici presenti nel polline o piuttosto ad un effetto di competizione biologica esercitato dalla microflora naturalmente presente nel polline

Presenza di Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in latte e formaggi ovicaprini in Toscana

La paratubercolosi è una malattia infettiva che colpisce principalmente i ruminanti domestici e selvatici, causata da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). MAP è stato associato allo sviluppo di malattie umane quali il morbo di Crohn, il diabete di tipo 1, la sarcoidosi, la sclerosi multipla e la tiroidite di Hashimoto. Lo scopo di questo studio è stato quello di determinare il livello di positività a MAP in campioni di latte massale e in formaggi pecorini e caprini a latte crudo prodotti in Toscana, Italia, come un'indicatore dell’esposizione umana a questo patogeno. I campioni sono stati analizzati mediante PCR ed esame colturale; il DNA di MAP è stato rilevato mediante un saggio di Real Time PCR in 46/96 (47,91%) campioni di formaggio e in 4/20 (20%) campioni di latte massale. L’esame colturale ha permesso l’isolamento in un solo caso, corrispondente ad un formaggio di capra che aveva anche dato esito positivo alla Real Time PCR e che è stato genotipizzato come ceppo S. La carica microbica dei campioni, analizzati mediante la Real Time PCR, variava da 12 a 1,8×104 cellule di MAP/gr di formaggio e da 1,2 a 12 cellule di MAP/ml di latte. Quindi, in Toscana, il latte crudo ed i formaggi ovicaprini possono costituire una fonte di esposizione umana a MAP

Sviluppo di una Real Time PCR duplex per la determinazione della carica virale di due stipiti di Small Ruminant Lentiviruses

I lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV) vengono classificati in 5 genotipi (A, B, C, D, E). Il genotipo E, recentemente identificato in capre di razza Roccaverano, è caratterizzato da due delezioni nel genoma, corrispondenti alla subunità dUTPasi del gene pol e del gene VPR-like, le quali gli conferiscono una minore virulenza. Gli animali appartenenti alla razza Roccaverano sono sempre stati considerati resistenti alle infezioni da SRLV, in particolare verso i ceppi artritici appartenenti al genotipo B (CAEV-like), introdotti nella langa astigiana negli anni ottanta con l’importazione di animali dalla Francia. Questa considerazione ha suggerito l'ipotesi che una precedente esposizione al ceppo Roccaverano possa conferire una resistenza su base immunologica verso stipiti eterologhi. Per meglio complendere questi meccanismi può risultare importante sviluppare un protocollo diagnostico in grado di evidenziare e quantificare la carica virale di target virali diversi (stipite Roccaverano e stipite artritico CAEV-Co) contemporaneamente e nello stesso templato di animali infettati con entrambe gli stipiti virali. L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di creare un saggio di duplex Real Time PCR, basato sul sistema Taqman, il quale permetta di quantificare contemporaneamente la carica provirale del ceppo CAEV-Co e del ceppo Roccaverano all’interno di uno stesso campione, utilizzando due sistemi primer-sonda indipendenti. La metodica sviluppata è stata successivamente applicata al DNA provirale estratto da animali con duplice infezione ed ha evidenziato come gli animali precedentemente infettati con il ceppo virale di Roccaverano presentino un numero di copie del provirus CAEV-Co significativamente inferiore rispetto ai soggetti non vaccinati

Valutazione della sopravvivenza di Mycobacterium avium paratuberculosis nel Parmigiano Reggiano e nel Grana Padano

Da molti anni si dibatte sul possibile coinvolgimento di Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), l’agente della paratubercolosi nei ruminanti, nell’eziologia di alcune patologie umane. I prodotti lattiero-caseari sono considerati dalla comunità scientifica quelli maggiormente responsabili dell’esposizione umana a MAP. Lo scopo di questo studio è stato quello di investigare la sopravvivenza di MAP nel Parmigiano Reggiano (PR) e nel Grana Padano (GP). Sono stati eseguiti due challenge tests per valutare la sopravvivenza di MAP durante l’affioramento e il processo produttivo di questi formaggi. Nel primo challenge test è stato osservato un decremento di MAP (ceppo di riferimento) di 0,8 log UFC/ml nel latte parzialmente scremato dopo l’affioramento. Nel secondo challenge test una diminuzione statisticamente significativa è stata osservata durante la formatura per quanto riguarda i ceppi di campo e dopo la salamoia per il ceppo di riferimento. Inoltre, una differenza statisticamente significativa è stata osservata durante la stagionatura, quando la concentrazione di MAP è scesa sotto al limite di rilevabilità, a partire dal secondo mese per quanto riguarda i ceppi di campo e dal terzo mese per il ceppo di riferimento. Il nostro studio apporta nuove conoscenze sugli effetti del processo produttivo del PR e del GP sulla sopravvivenza di MAP e ci permette di definire trascurabile la probabilità di sopravvivenza di MAP alla fine del processo di stagionatura

Screening of biogenic amines production by bacteria isolated from "pecorino" cheese

Biogenic amines (BA) are naturally present in many foods and beverages, especially fermented ones. Due to their toxicity, high levels of BAs in food can be a health risk. In cheese the most abundant amine is tyramine (TYR) which is the main cause of the so-called “cheese reaction”. BAs presence in food is mainly caused by aminoacids decarboxylating bacteria. Aim of the study is toevaluate BAs in vitro production by bacteria isolated from a medium-ripened “pecorino” cheese.Materials and Methods: 72 strains of potential BAs producers (Enterococci (Ec), Enterobacteriaceae (Eb) and mesophilic lactobacilli (Lb)) were isolated during the cheesemaking and the ripening phases of a “pecorino” cheese, manufactured in a dairy factory in Tuscany. Ec (34) and Lb (28) were identified by PCR [1,2,3,4], Eb (10) were identified by API 20E kit (Biomérieux). After 72h incubation in a decarboxylase broth added with 1% w/v of the precursor aminoacids, the production of 7 BAs (triptamine, 2-phenylethylamine (2PHE), putrescine (PUT), cadaverine (CAD), histamine, TYR, spermidine, spermine) was quantified on the acid extract of the cultural medium by HPLC analysis as described in a previous study [5]. All the strain tested produced BAs although in varying degrees. Overall our data on BAs production by the different microbial groups agree with previous studies [6,7,8,9]. Eb were confirmed as good PUT and CAD producers, both for number of decarboxylating strains (100% and 90% respectively) and for BAs concentrations (on average 341 and 785 µg/ml, respectively). All Ec strains produced TYR, with very high mean amounts (1608µg/ml), and many of them gave not negligible 2PHE, PUT and CAD production (on average 184, 121 and 146 µg/ml, respectively). These data agree with Ladero et al. [10] hypothesis that TYR production is genomic trait of E. faecium and E. faecalis species. On the other hand the same Authors speculated that PUT is a genomic trait of E. faecalis, while in our study 50% of the tested strains of this species showed no detectable PUT production. Indeed, other Authors reported PUT-negative strains of E. faecalis [6,9,11]. Strains that produce high amounts of BAs, although with a low prevalence, when growing to high cell counts can substantially contribute to BAs formation [9]. In view of this, it is noteworthy that, although our data confirm that Lb are overall not good BA producers, few Lb strains, isolated from pasteurized milk cheeses, produced very high amounts of TYR (810, 1766 and 1959 µg/ml). BA presence in cheeses is not solely associated with undesired bacterial groups (Eb, Ec), but technologically useful microorganisms, like Lb, could play a role in TYR accumulation in ripened cheeses, especially considering the high Lb loads reached and maintained throughout the ripening period

Detection of genes encoding for enterotoxins, TSST-1, and biofilm production in coagulase-negative staphylococci from bovine bulk tank milk

Coagulase-negative staphylococci (CNS) represent common skin commensals in humans and other mammals. They are opportunistic microorganisms and, in dairy production, are considered as minor pathogens, often associated to subclinical mastitis. It has been recently demonstrated that CNS can produce Staphylococcus aureus superantigens, as well as biofilm. In our study, 74 CNS were isolated from Tuscan (Central Italy) bovine bulk tank milk and phenotypically identified as Staphylococcus xylosus (28.4 %), Staphylococcus chromogenes (20.3 %), Staphylococcus sciuri (12.2 %), Staphylococcus hominis (9.4 %), Staphylococcus haemolyticus (6.8 %), Staphylococcus capitis (5.4 %), Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (4.1 %), Staphylococcus saprophyticus (4.1 %), and Staphylococcus simulans (4.1 %). Moreover, one isolate (1.3 %) was detected for each of the following species: Staphylococcus caprae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lentus, and Staphylococcus warneri. All isolates were screened by PCR for the presence of genes encoding classical enterotoxins (sea-see), toxic shock syndrome toxin-1 (tst), and biofilm (icaA/D). Forty isolates (54.1 %) presented at least one gene encoding for enterotoxin production, 15 (20.3 %) harbored two or more genes in association. The most frequently detected gene was sea (41.9 %), followed by sec-1 (25.7 %). None of the tested isolates presented genes encoding for enterotoxin B or D. Fifteen isolates (20.3 %) presented genes encoding for biofilm production. Among these, 11 isolates also harbored genes encoding for enterotoxin production. Our results suggest that enterotoxigenic CNS could represent a potential reservoir of pathogenicity factors, which could substantially contribute to enhance S. aureus virulence when present in milk and milk products. Further investigations are required for the evaluation of enterotoxins and biofilm production