Embriogénesis somática en Carica papaya L. var. Maradol rojo

The most important papaya variety in Cuba is Red Maradol. However, it is susceptible to the main viral diseases that attack this crop. For this reason, it is necessary to establish a method for plant regeneration via somatic embryogenesis as the base to develop a protocol for genetic transformation to obtain resistant plants. The objective of this work was to obtain somatic embryos of papaya Red Maradol starting from zygotic embryos. The effect of different factors in somatic embryogenesis and plant regeneration, starting from immature zygotic embryos, was evaluated. The somatic embryos were obtained in a culture medium MS with 5 mg.l-1 2,4-D. Also, the use of 2 mg.l-1 of this plant growth regulator had a positive effect in the secondary multiplication of somatic embryos. The addition of 5 mg.l-1 AIB favored the buds rooting (78.0%), but its longitude was inferior to 1.85 cm. The culture of buds in liquid elongation medium allowed them to reach an average longitude of 3.05 cm and 4.50 leaves, which permitted its appropriate survival in the acclimatization phase.Key words: acclimatization, papaya, secondary multiplication, zygotic embryosLa variedad más importante de papaya en Cuba es la Maradol rojo. Sin embargo, es susceptible a las principales enfermedades virales que atacan al cultivo. Por esta razón se requiere establecer un método de regeneración de plantas vía embriogénesis somática que sirva de base al desarrollo de un protocolo de transformación genética para obtener plantas resistentes. El objetivo de este trabajo fue obtener embriones somáticos de papaya Maradol Rojo a partir de embriones cigóticos. Para ello, se evaluó el efecto de diferentes factores en la embriogénesis somática y la regeneración de plantas a partir de embriones cigóticos inmaduros. Los embriones somáticos se obtuvieron en un medio de cultivo MS con 5 mg.l-1 de 2,4-D. Además, el empleo de 2 mg.l-1 de este regulador del crecimiento tuvo un efecto positivo en la multiplicación secundaria de los embriones somáticos. La adición de 5 mg.l-1 de AIB promovió el enraizamiento de los brotes en un 78.0%, pero su longitud fue inferior a 1.85 cm. El cultivo de los brotes en medio líquido de elongación permitió que estos alcanzaran una longitud promedio de 3.05 cm y 4.50 hojas, lo cual propició su adecuada supervivencia en la fase de aclimatización.Palabras clave: aclimatización, embriones cigóticos, papaya, multiplicación secundari

Efecto del tiempo de inoculación en la eficiencia de la transformación mediada por Agrobacterium de Musa cv. ‘Grande naine’ (AAA)

Increasing inoculation time during Agrobacterium-mediated transformation has been shown to favour transformation efficiency in several plant species. The effect of inoculation time in combination with spermidine (Spd) on efficiency was determined during Agrobaterium-mediated transformation of the Musa cultivar ‘Grande naine’ (AAA). Banana embryogenic cell suspensions (ECSs) were incubated with the bacterial strain EHA 105 carrying the binary vector pFAJ3000. Six different inoculation conditions (6 h, 6 h+Spd, 12 h, 12 h+Spd, 24 h, 24 h+Spd) were compared based on transient GUS expression and number of embryo colonies formed. Moreover, leaf fragments from 24 randomly chosen regenerated plantlets were assayed presence and expression of the transgenes. Consequently, samples that were inoculated for 24 h in medium supplemented with 1 mM spermidine showed the highest transformation efficiency, expressed as number of blue foci and regenerated colonies after the selection treatment. Here we showed for the first time that longer inoculation times in combination with spermidine enhance the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of the banana cultivar ‘Grande naine’.   Keywords: banana, β-glucuronidase, genotype, somatic embryo, PCREl incremento en el tiempo de inoculación durante la transformación mediada por Agrobacterium ha mostrado que aumenta la eficiencia de la transformación en varias especies de plantas. En este trabajo se determinó el efecto del tiempo de inoculación en combinación con la adición de espermidina (Spd) en la eficiencia de la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens del cv. ‘Grande naine’ (Musa AAA). Las suspensiones celulares embriogénicas de banano fueron inoculadas con la cepa bacteriana EHA 105 que contiene el vector binario pFAJ3000. Se compararon seis condiciones de inoculación (6 h, 6 h+Spd, 12 h, 12 h+Spd, 24 h, 24 h+Spd) en cuanto a la expresión transitoria GUS y el número de colonias embriogénicas formadas. Además, se analizaron fragmentos de hojas de 24 plántulas regeneradas para la presencia y expresión de los transgenes. Consecuentemente, las muestras por 24 h con 1 mM de espermidina mostraron la mayor eficiencia de transformación, expresada en número de puntos azules y colonias regeneradas después de la selección. En este trabajo se muestra por primera vez que el aumento del tiempo de inoculación en combinación con el uso de espermidina incrementa la eficiencia de la transformación genética mediada por Agrobacterium en el cultivar ‘Grande naine’ de banano.   Palabras clave: banano, β-glucuronidasa, genotipo, suspensiones celulares embriogénicas, PC

Empleo de los marcadores AFLP para la caracterización molecular de dos cultivos con interés agrícola

The AFLP technique is based on the selective amplification of restriction fragment by polymerase chain reaction (PCR) and consists of four basic steps; digestion with restriction enzymes of deoxyribonucleic acid (DNA), adapter ligation with fragments of DNA and amplification of the fragments obtained in the earlier steps using combinations of selective primers and detection of polymorphism using radioisotopes, fluorescent dyes or silver staining. It is widely used in the evaluation of genetic diversity, analysis of genetic distance, DNA fingerprint, germoplasm collections analysis, genetic maps construction and markers diagnostic monitoring. In order to characterize molecularly two species of crops with agricultural interests (sugar cane and banana) were generated AFLP markers. In this study was demonstrated the ability to identify variations in the genome of crops studied.Key words: Musa, ‘Navolean’, Saccharum officinarum, sugarcaneLa técnica de AFLP, está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y consta de cuatro etapas fundamentales; digestión con enzimas de restricción del ácido desoxirribonucleico (ADN), ligazón de los adaptadores con los fragmentos de ADN, amplificación de los fragmentos obtenidos en la etapa anterior empleando combinaciones de cebadores selectivos y detección del polimorfismo utilizando radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción de plata. Se utiliza ampliamente en la evaluación de diversidad genética, análisis de distancia genética, huella identificadora de ADN, análisis de colecciones de germoplasma, construcción de mapas genéticos y seguimiento de marcadores de diagnóstico. Con el objetivo de caracterizar molecularmente dos especies de cultivos con interés agrícola (caña de azúcar y plátano) se generaron marcadores AFLP. Se demostró la capacidad para identificar variaciones en el genoma de los cultivos estudiados.Palabras clave: caña de azúcar, Musa, ‘Navolean’, Saccharum officinaru

Obtención de plantas madre de Vasconcellea x helbornii (Badillo) Badillo a partir de estacas en condiciones semicontroladas

The babaco [Vasconcellea x helbornii (Badillo) Badillo] also known as mountain papaya is a native fruit from the highlands of Ecuador and Colombia. The present work was carried out with the objective of establishing a bank of donor plants of the babaco hybrid from cuttings, under semicontrolled conditions. Two-year-old plants grown in greenhouse was used as initial plant material. Subsequently, the stem was divided into different sections of 25 cm in length. These were planted in plastic sheaths with substrate and subjected to a phytosanitary control with 0.5% (v / v) Carbendazim fungicide. At six weeks of culture, the number of rooted cuttings, the number and length of shoots and number of leaves per cutting were quantified. The effect of biostimulant application (GERMO-TB01) was also determined to increase the number of axillary shoots. The results of this work allowed to reach a 100% budding and root formation in the different sections of stem. The best results in the formation of new shoots were reached in explants S1, S2 and S3. However, when applying the biostimulant the formation of new shoots increased to 5.82 per stem sections with better quality. Since the results of this work will be available donor plant material to develop in vitro propagation protocols of this hybrid, with high genetic and phytosanitary quality. Key word: bio-stimulant, donor plant material, greenhouse, rootingEl babaco [Vasconcellea x helbornii (Badillo) Badillo] conocido también como papaya de montaña es una fruta originaria de las zonas altas de Ecuador y Colombia. El presente trabajo se realizó con el objetivo de establecer un banco de plantas donadoras del híbrido babaco, a partir de estacas, bajo condiciones  semicontroladas. Como material vegetal se emplearon  plantas de dos años de edad cultivadas en casas de cultivo. Posteriormente, se dividió el tallo en diferentes secciones de 25 cm de longitud. Estas fueron plantadas en fundas plásticas con sustrato y sometidas a un control fitosanitario con fungicida Carbendazim al 0.5% (v/v) y se cuantificó a las seis semanas de cultivo, el número de estacas enraizadadas, el número y longitud de los brotes y número de hojas por estaca. También se determinó el efecto de la aplicación del bioestimulante (GERMO-TB01) para lograr aumentar el número de brotes axilares.  Los resultados de este trabajo permitieron alcanzar un 100% de brotación y formación de raíces en las diferentes secciones de tallo. Los mejores resultados en la formación de nuevos brotes se alcanzaron en los explante S1, S2 y S3. Sin embargo, al aplicar el bioestimulante la formación de nuevos brotes se incrementó a 5.82 por sección del tallo, con una mejor calidad. Con los resultados de este trabajo se dispondrá de material vegetal donante para desarrollar protocolos de propagación in vitro de este híbrido, con alta calidad genética y fitosanitaria. Palabras clave: bioestimulante, casa de cultivo, enraizamiento, material vegetal donant

Inducción de la embriogénesis somática en Cocos nucifera L. a partir de inflorescencias inmaduras

Including all the methods of vegetative multiplication, the somatic embryogenesis is the most promising for coconut multiplication. Immature inflorescences of Coppery Malay from different ages trees were used. Three concentrations of 2,4-D were used (70, 90 and 110 mg.l-1) in the culture medium. Differences were observed in the browning (phenolic compounds) of the explants depending on the age of the spates, explants from spates between 1.0 to 2.5 cm not show browning while more than 17.0 cm show browning until death. The somatic embryos began to be observed approximately from 45 days of the start the experiment without previous calli formation. Significant differences were observed in the somatic embryogenesis formation in order of the age of the spates and the concentrations of 2,4-D. The biggest percents of embryogenics explants were obtained among the inflorescences between 7.0 and 13.5 cm of spate long, which were between 41.6 and 48.6%. The most effective doses of 2,4-D were the highest (90 and 110 mg.l-1 of 2,4-D) with 36 and 38% of embryogenic explants respectively.Keywords: age of explants,Browning, 2,4DDentro de los métodos de multiplicación vegetativa, la embriogénesis somática se considera el más prometedor para la multiplicación del cocotero (Cocos nucifera L.). Se tomaron inflorescencias inmaduras de diferentes edades de árboles Malayo Cobrizo induciéndose la embriogénesis somática con tres concentraciones de ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) (70, 90 y 110 mg.l-1) en el medio de cultivo. Se observaron diferencias en la fenolización de los explantes en dependencia de la edad de las espatas, los explantes de las espatas entre 1.0 y 2.5 cm no se fenolizaron mientras que las mayores que 17.0 cm se fenolizaron provocando la muerte del explante. A los 45 días aproximadamente de la siembra comenzaron a observar los embriones somáticos sin previa formación de callos, encontrándose diferencias significativas en la respuesta embriogénica en función de la edad de las espatas y las concentraciones de 2,4-D. Los mayores porcentajes de explantes con embriones somáticos se obtuvieron entre las inflorescencias de 7.0 y 13.5 cm de longitud de la espata, los cuales estuvieron entre 41.6 y 48.6 %. Las dosis de 2,4-D más efectivas fueron las más elevadas (90 y 110 mg.l-1), con 36 y 38 % de explantes embriogénicos respectivamente.Palabras clave: edad del explante, fenolización, 2,4

Determinación de la dosis letal mínima de fosfinotricina para la selección de transformantes de banano cv. Grande naine (Musa AAA)

The present work had the objective of determining the minimum lethal doses of the selective agent phosphineotricine, to establish the adequate conditions for the selection of genetically transformed cellular embryogenic aggregates of banana cultivar Grande Naine. Schenk and Hildebrandt culture medium, modified by Bieberach, was used , adding different concentrations of the selective agent at (0, 3, 6, 9 and 12 mg. l-1). The evaluation of the survival of the explants was carried out visually to the 30 days of culture using the scale elaborated in this work, as well as the cellular vitality for staining with Diacetate of Fluoresceine (DAF). The concentrations of the selective agent used, were the cause of the plant cells death. This effect was increased when increasing the concentration and the time of exposition from the vegetable material to the culture medium with the selective agent (increase of the toxicity). The minimal lethal doses selected was 6 mg.l-1 because the total necrosis in the banana cells and death of the tissue produced when was observed to the microscope the vitality of the cellular aggregates.Key words: cellular aggregates, genetic transformation, selection agentsEl presente trabajo tuvo como objetivo determinar la dosis letal mínima del agente selectivo fosfinotricina, para establecer las condiciones adecuadas de selección de agregados celulares embriogénicos de banano cv. ‘Grande naine’ transformados genéticamente. Se empleó el medio de cultivo Schenk y Hildebrandt, modificado por Bieberach, al que se adicionaron diferentes concentraciones del agente selectivo (0, 3, 6, 9 y 12 mg. l-1). La evaluación del número de explantes muertos se realizó de forma visual a los 30 días de cultivo con la ayuda de una escala de grados elaborada en el trabajo, así como la vitalidad celular por tinción con Diacetato de Fluoresceína (DAF). Las concentraciones del agente selectivo empleadas provocaron la muerte de las células vegetales. Este efecto se incrementó al aumentar la concentración y el tiempo de exposición del material vegetal al medio con el agente selectivo (incremento de la toxicidad). Se seleccionó como la dosis letal mínima la de 6 mg.l-1, por ser la que produjo necrosis total en las células de banano y muerte del tejido cuando se observó al microscopio la vitalidad de los agregados celulares.Palabras clave: agentes de selección, agregados celulares, transformación genétic

Efecto de dos medios de cultivo en la elongación in vitro de brotes de Pinus taeda L.

Pinus taeda L. is a forest species of great international importance and in Argentina. Biotechnological techniques can provide an alternative to propagate this species, as well as for obtaining mother plants. The aim of this study was to achieve adequate elongation of in vitro shoots before transfer to the rooting stage. The shoots were obtained from acclimatized mother plants. It was disinfected for in vitro establishment. Two types of basal culture media: WV5 and DCR were studied. The best results were achieved with the combination of the WV5 salts supplement with 0.5% activated carbon, 0.01 mg l-1 ANA to obtain vigorous and longer than 40.0 mm in length shoots. Key words: forest, micropropagation, pinePinus taeda L. es una especie forestal de gran importancia a nivel internacional y en la Argentina. Las técnicas biotecnológicas puede constituir una alternativa para la propagación de esta especie, así como para la obtención de plantas madre. El objetivo de este trabajo fue lograr una adecuada elongación de los brotes in vitro antes de pasar a la fase de enraizamiento. A partir de plantas madre aclimatizadas fueron obtenidos brotes que se desinfectaron para su establecimiento in vitro. Se estudiaron dos tipos de medios de cultivo basal DCR y WV5. Los mejores resultados se alcanzaron con el empleo de las sales WV5 con 0.5% de carbón activado y 0.01 mg l-1 de ANA. Los brotes fueron vigorosos y mayores de 40.0 mm de longitud. Palabras clave: forestal, micropropagación, pin

Formación de callos y establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas de caña de azúcar a partir de segmentos de hojas de plantas in vitro

The somatic embryogenesis, propagation technique and tool for the genetic improvement in sugar cane (Saccharum spp. hybrid), has presented multiple inconveniences that the regeneration protocols described in the literature have not been able to solve. The present research was carried out with the objective of developing a new methodology for the establishment of cells suspensions of sugar cane, var. C 87-51, somatic embryogenesis starting from segments of the sheath of the leaves of plants in vitro, placed directly in a liquid culture medium. The results demonstrated that it is possible to form callus with embryogenic structures starting from the segment two of the sheath of the leaves which reduces the time of culture in vitro and guarantees the physiologic and phytosanitary quality of the plants that are regenerated. Homogeneous lines of cellular suspensions formed by embryogenic agregates were established starting from callus with embryogenic structure.Key words: in vitro plant, Saccharum spp. hybrid, somatic embryogenesisLa embriogénesis somática, técnica de propagación y herramienta para el mejoramiento genético en caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido), ha presentado múltiples inconvenientes que los protocolos de regeneración descritos en la literatura no han sido capaces de resolver. La presente investigación se realizó con el objetivo de desarrollar una nueva metodología para el establecimiento de suspensiones celulares de caña de azúcar, var. C 87-51, vía embriogénesis somática a partir de segmentos de la vaina de las hojas de plantas in vitro, colocados directamente en medio de cultivo líquido. Los resultados demostraron que es posible formar callos con estructuras embriogénicas a partir del segmento dos de la vaina de las hojas; lo cual reduce el tiempo de cultivo in vitro y garantiza la calidad fisiológica y fitosanitaria de las plantas que se regeneran. A partir de los callos con estructuras embriogénicas se establecieron líneas homogéneas de suspensiones celulares formadas por agregados embriogénicos.Palabras clave: embriogénesis somática, plantas in vitro, Saccharum spp. híbrid

Obtención de callos con estructuras embriogénicas de Stevia rebaudiana Bert. en medios de cultivo semisólidos

The adjustment of an efficient protocol of somatic embryogenesis in Stevia rebaudiana Bertoni to support programs of genetic breeding by genetic transformation is necessary. Few results are registered up to the moment in this species. The objective of this work was to obtain calli with embryogenic structures from clones of Stevia in vitro plants. Different variables were studied for the formation of calli: explants type, incubation conditions and genotype influences. Culture medium MS with different growth regulators (2,4-D; 6-BAP; TDZ) was used. These were used alone or in combination. Calli were multiplied in the best culture media. Afterwards they were subcultured to culture medium containing 2,4-D or TDZ with 40 and 60 g.l-1 of sucrose to induce proembryogenic mass formation. Calli formation was achieved after 45 days of culture in darkness and in culture media with 2.26 μM 2,4-D and 2.22 μM 6-BAP or 1.13 μM 2,4-D and 0.45 μM of TDZ. Foliar explants of in vitro plants of Stevia were used. Multiplication was achieved in the same culture media for calli formation. The largest amount of calli with development of proembryogenic mass was obtained when subcultures to culture medium with 0.45 μM 2,4-D adding 40 g.l-1 of sucrose was carried out after 45-50 days of culture.Key words: in vitro culture, leaf explant, sweet herbEl ajuste de un protocolo eficiente de embriogénesis somática en Stevia rebaudiana Bertoni serviría de apoyo a programas de mejoramiento genético por transformación genética, sobre lo cual existen hasta el momento muy pocos resultados en esta especie. Por estas razones, el objetivo de este trabajo fue obtener callos con estructuras embriogénicas de clones de yerba dulce a partir de plantas in vitro. Para la formación de callos se estudiaron variables como: el tipo de explante, condiciones de incubación e influencia del genotipo. Se empleó el medio de cultivo MS con diferentes reguladores de crecimiento solos o en combinación (2,4-D; 6-BAP; TDZ). Los callos fueron multiplicados en los mejores medios de cultivo y posteriormente fueron subcultivados a medios de cultivo que contenían 2,4-D o TDZ con 40 y 60 g.l-1 de sacarosa para inducir la formación de masas proembriogénicas. Se logró la formación de callos, luego de 45 días de cultivo en la oscuridad en medios de cultivo con 2.26 μM de 2,4-D y 2.22 μM de 6-BAP ó 1.13 μM de 2,4-D y 0.45 μM de TDZ, con el empleo de explantes foliares de plantas in vitro de yerba dulce. La multiplicación fue posible realizarla en los mismos medios de cultivo de formación de callos. Al subcultivarlos a medios de cultivo con 0.45 μM de 2,4-D más la adición de 40 g.l-1 de sacarosa se obtuvo la mayor cantidad de callos con desarrollo de masas proembriogénicas luego de 45-50 días de cultivo.Palabras clave: cultivo in vitro, explantes foliares, yerba dulc