Identification of Single Nucleotide Polymorphisms and analysis of Linkage Disequilibrium in sunflower elite inbred lines using the candidate gene approach

Background. Association analysis is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. This includes the estimation of nucleotide diversity, the assessment of linkage disequilibrium structure (LD) and the evaluation of selection processes. Trait mapping by allele association requires a high-density map, which could be obtained by the addition of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) and short insertion and/or deletions (indels) to SSR and AFLP genetic maps. Nucleotide diversity analysis of randomly selected candidate regions is a promising approach for the success of association analysis and fine mapping in the sunflower genome. Moreover, knowledge of the distance over which LD persists, in agronomically meaningful sunflower accessions, is important to establish the density of markers and the experimental design for association analysis. Results. A set of 28 candidate genes related to biotic and abiotic stresses were studied in 19 sunflower inbred lines. A total of 14,348 bp of sequence alignment was analyzed per individual. In average, 1 SNP was found per 69 nucleotides and 38 indels were identified in the complete data set. The mean nucleotide polymorphism was moderate ( = 0.0056), as expected for inbred materials. The number of haplotypes per region ranged from 1 to 9 (mean = 3.54 1.88). Model-based population structure analysis allowed detection of admixed individuals within the set of accessions examined. Two putative gene pools were identified (G1 and G2), with a large proportion of the inbred lines being assigned to one of them (G1). Consistent with the absence of population sub-structuring, LD for G1 decayed more rapidly (r 2= 0.48 at 643 bp; trend line, pooled data) than the LD trend line for the entire set of 19 individuals (r2= 0.64 for the same distance). Conclusion. Knowledge about the patterns of diversity and the genetic relationships between breeding materials could be an invaluable aid in crop improvement strategies. The relatively high frequency of SNPs within the elite inbred lines studied here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kbp (r2∼0.1) suggest that high resolution association mapping in sunflower could be achieved with marker densities lower than those usually reported in the literature.Fil:Fusari, C.M. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Fil:Lia, V.V. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Fil:Hopp, H.E. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Fil:Heinz, R.A. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Population structure and genetic diversity characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers

BACKGROUND: Argentina has a long tradition of sunflower breeding, and its germplasm is a valuable genetic resource worldwide. However, knowledge of the genetic constitution and variability levels of the Argentinean germplasm is still scarce, rendering the global map of cultivated sunflower diversity incomplete. In this study, 42 microsatellite loci and 384 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were used to characterize the first association mapping population used for quantitative trait loci mapping in sunflower, along with a selection of allied open-pollinated and composite populations from the germplasm bank of the National Institute of Agricultural Technology of Argentina. The ability of different kinds of markers to assess genetic diversity and population structure was also evaluated.Fil: Filippi, Carla Valeria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Aguirre, Natalia Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Rivas, Juan Gabriel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Zubrzycki, Jeremías Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Puebla, Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Cordes, Diego. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Córdoba. Estación Experimental Agropecuaria Manfredi; ArgentinaFil: Moreno, Maria V.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Córdoba. Estación Experimental Agropecuaria Manfredi; ArgentinaFil: Fusari, Corina M.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Alvarez, Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Córdoba. Estación Experimental Agropecuaria Manfredi; ArgentinaFil: Heinz, Ruth Amelia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Paniego, Norma Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Lia, Verónica Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Apoplastic class III peroxidases PRX62 and PRX69 regulate ROS-homeostasis and cell wall associated extensins linked to root hair growth at low-temperature in Arabidopsis thaliana

Root hairs (RH) growth is highly influenced by endogenous as well as by external environmental signals that coordinately regulate its final cell size. RHs actively expand the root surface responsible for nutrient uptake and water absorption. We have recently determined that RH growth was unexpectedly boosted when Arabidopsis thaliana seedlings are cultivated at low temperatures. It was proposed that RH growth plasticity in response to cold was linked to a reduced nutrient availability in the media. Here, we explored the molecular basis of this strong RH growth response by using the Genome Wide Association Studies (GWAS) approach on Arabidopsis thaliana natural accessions. We identified the poorly characterized PEROXIDASE 62 (PRX62) as a key protein triggering this conditional growth under a moderate low-temperature stress. In addition, we identified the related protein PRX69 as an important factor in this developmental process. The prx62 prx69 double mutant and the PRX62 and PRX69 over-expressing lines showed contrasting RH phenotypes, peroxidase activities and cyt/apoReactive Oxygen Species (ROS) levels. Strikingly, a cell wall protein extensin (EXT) reporter revealed the effect of peroxidase activity on the EXT cell wall association at 10C in the RH apical zone. EXT cell wall insolubilization was enhanced at 10C, which was completely abolished under the PRX inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM) treatment. Finally, we demonstrated that the Root Hair defective 6 like 4 (RSL4) transcription factor directly controls the expression of PRX69 under low-temperature. Collectively, our results indicate that both PRX62 and PRX69 are key apoplastic PRXs that modulate ROS-homeostasis and cell wall EXT-insolubilization linked to RH elongation at low-temperature.Fil: Martinez Pacheco, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ranocha, Philippe. Université de Toulouse; FranciaFil: Kasulin, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Fusari, Corina Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Servi, Lucas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ferrero, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Berdion Gabarain, Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Peralta, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Borassi, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Marzol, Eliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Rodriguez Garcia, Diana Rosa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Rondon Guerrero, Yossmayer del Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Carignani Sardoy, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Botto, Javier Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Meneses, Claudio. Universidad Andrés Bello; ChileFil: Ariel, Federico Damian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Petrillo, Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dunand, Christophe. Université de Toulouse; FranciaFil: Estevez, Jose Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Universidad Andrés Bello; Chil

Apoplastic class III peroxidases PRX62 and PRX69 promote Arabidopsis root hair growth at low temperature

Root Hairs (RHs) growth is influenced by endogenous and by external environmental signals that coordinately regulate its final cell size. We have recently determined that RH growth was unexpectedly boosted when Arabidopsis thaliana seedlings are cultivated at low temperatures. It was proposed that RH growth plasticity in response to low temperature was linked to a reduced nutrient availability in the media. Here, we explore the molecular basis of this RH growth response by using a Genome Wide Association Study (GWAS) approach using Arabidopsis thaliana natural accessions. We identify the poorly characterized PEROXIDASE 62 (PRX62) and a related protein PRX69 as key proteins under moderate low temperature stress. Strikingly, a cell wall protein extensin (EXT) reporter reveals the effect of peroxidase activity on EXT cell wall association at 10 °C in the RH apical zone. Collectively, our results indicate that PRX62, and to a lesser extent PRX69, are key apoplastic PRXs that modulate ROS-homeostasis and cell wall EXT-insolubilization linked to RH elongation at low temperature.Fil: Martinez Pacheco, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ranocha, Philippe. Instituto Polytechnique de Toulouse; FranciaFil: Kasulin, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Fusari, Corina Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; ArgentinaFil: Servi, Lucas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Aptekmann, Ariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Berdion Gabarain, Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Peralta, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Borassi, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Marzol, Eliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Rodriguez Garcia, Diana Rosa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Rondon Guerrero, Yossmayer del Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Carignani Sardoy, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ferrero, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Botto, Javier Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Meneses, Claudio. Universidad Andrés Bello; ChileFil: Ariel, Federico Damian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; ArgentinaFil: Nadra, Alejandro Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Petrillo, Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dunand, Christophe. Instituto Polytechnique de Toulouse; FranciaFil: Estevez, Jose Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin

Mapeo por asociación en girasol: diversidad nucleotídica, desequilibrio de ligamiento e identificación de genes involucrados en la resistencia a la podredumbre húmeda del capítulo

Tesis para obtener el grado de Doctora en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2010El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.Association mapping is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) have become the markers of choice to conduct these studies. The aims of this thesis were to study nucleotide diversity and the extent of linkage disequilibrium (LD) in cultivated sunflower to conduct association mapping for the resistance to Sclerotinia Head Rot disease. SNP frequency and nucleotide diversity were assessed using a set of 31 genes and 19 sunflower inbred lines (1SNP/61 pb, θ=0.0067). The relatively high frequency of SNPs found here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kb (r2~0.1) allowed the development of an association mapping strategy through candidate gene approach. A total of 30 genes were selected based on: (1) a microarray analysis from Brassica napus genotypes resistant to S. sclerotiorum, (2) differentially expressed genes from cDNA libraries from sunflower infected tissues; (3) previous literature reports. Different methods of candidate gene selection and optimization of SNP genotyping technologies for scale-up throughput were explored. CEL1 cleavage of heteroduplex (CEL1CH) and denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC) proved to be robust and versatile techniques to increase the amount of loci and individuals to be included in the association panel. Sixteen genes were successfully genotyped in the association population composed by 134 inbred lines from INTA Manfredi Sunflower Germplasm Bank. Mixed linear models accounting for population structure and kinship relatedness were used for the statistical analysis of associations. One candidate gene, RhoBP_B, had significant results from association analysis, indicating that it might affect the quantitave variation in sunflower resistance to Sclerotinia Head Rot disease. These results demonstrate the potential of candidate gene association mapping for complex trait dissection in sunflower.Instituto de BiotecnologíaFil: Fusari, Corina Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentin

Association mapping in sunflower: nucleotide diversity, linkage disequilibrium and identification of genes involved in sclerotinia head rot resistance

El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.Association mapping is a powerful tool to identify gene loci that may contribute to phenotypic variation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) have become the markers of choice to conduct these studies. The aims of this thesis were to study nucleotide diversity and the extent of linkage disequilibrium (LD) in cultivated sunflower to conduct association mapping for the resistance to Sclerotinia Head Rot disease. SNP frequency and nucleotide diversity were assessed using a set of 31 genes and 19 sunflower inbred lines (1SNP/61 pb, θ=0.0067). The relatively high frequency of SNPs found here, along with the predicted extent of LD over distances of 100 kb (r2~0.1) allowed the development of an association mapping strategy through candidate gene approach. A total of 30 genes were selected based on: (1) a microarray analysis from Brassica napus genotypes resistant to S. sclerotiorum, (2) differentially expressed genes from cDNA libraries from sunflower infected tissues; (3) previous literature reports. Different methods of candidate gene selection and optimization of SNP genotyping technologies for scale-up throughput were explored. CEL1 cleavage of heteroduplex (CEL1CH) and denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC) proved to be robust and versatile techniques to increase the amount of loci and individuals to be included in the association panel. Sixteen genes were successfully genotyped in the association population composed by 134 inbred lines from INTA Manfredi Sunflower Germplasm Bank. Mixed linear models accounting for population structure and kinship relatedness were used for the statistical analysis of associations. One candidate gene, RhoBP_B, had significant results from association analysis, indicating that it might affect the quantitave variation in sunflower resistance to Sclerotinia Head Rot disease. These results demonstrate the potential of candidate gene association mapping for complex trait dissection in sunflower.Fil:Fusari, Corina Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Estructura electrónica de análogos sintéticos de las bases nitrogenadas del ADN

Se estudiaron mediante cálculos cuánticos semiempíricos los pares de bases del ADN formados por las bases naturales y por análogos sintéticos de la adenina (Z) y timina (F). Estas moléculas sintéticas, en los procesos de replicación, sustituyen a las naturales replicando perfectamente el ADN. Se obtuvieron gráficos de densidad de carga y potencial electrostático que permiten comprender la formación de los enlaces de hidrógeno necesarios para la estabilidad de las bases apareadas. Se estudiaron los pares A-T, A-F, Z-T  Z-F a los efectos de determinar las interacciones del apareamiento. Nuestros resultados indiquen que, para la replicación del ADN, es de mayor importancia la complementariedad estructural (el efecto estérico), que los posibles enlaces de hidrógeno formados entre pares cuando incluyen algún análogo sintético.Fil: Fusari, Corina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Departamento de Física; ArgentinaFil: Sferco, Silvano Juan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química; Argentin

SNP genotyping by heteroduplex analysis

Heteroduplex-based genotyping methods have proven to be technologically effective and economically efficient for low- to medium-range throughput single-nucleotide polymorphism (SNP) determination. In this chapter we describe two protocols that were successfully applied for SNP detection and haplotype analysis of candidate genes in association studies. The protocols involve (1) enzymatic mismatch cleavage with endonuclease CEL1 from celery, associated with fragment separation using capillary electrophoresis (CEL1 cleavage), and (2) differential retention of the homo/heteroduplex DNA molecules under partial denaturing conditions on ion pair reversed-phase liquid chromatography (dHPLC). Both methods are complementary since dHPLC is more versatile than CEL1 cleavage for identifying multiple SNP per target region, and the latter is easily optimized for sequences with fewer SNPs or small insertion/deletion polymorphisms. Besides, CEL1 cleavage is a powerful method to localize the position of the mutation when fragment resolution is done using capillary electrophoresis.Instituto de BiotecnologíaFil: Paniego, Norma Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Fusari, Corina Mariana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Lia, Veronica Viviana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Puebla, Andrea Fabiana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentin