Study of different parameters in the production of lytic enzymes

The aim of this work was to study the effects of different parameters in the production of β-1,3 glucanases, proteases and chitinases by Cellulosimicrobium celulans 191, in culture media A, B and C, respectively. The experimental designs employed were 2³ factorial designs, and the factors studied were: initial pH, temperature and rotary shaker speed. The experimental results for the production of β-1,3 glucanase in culture medium A showed maximum activity (0.64 U.mL-1) with an initial pH of 8.5 after 24 hours of fermentation at 33 ºC and 200 rpm. The parameters pH, rotary shaker speed and the interaction of all the parameters presented statistical significance. The experimental results for protease production in culture medium B showed maximum activity (4.25 U.mL-1) with an initial pH of 6.5 after 30 hours of fermentation at 20 ºC and 200 rpm. The pH was the only parameter that presented statistical significance. The experimental results for chitinase production in culture medium C showed maximum activity (7.06 U.mL-1) at an initial pH of 5.5 after 72 hours of fermentation at 25 ºC and 200 rpm. All the parameters and their interactions presented statistical significance. The determination coefficients of the analysis of variance and F tests demonstrated that the linear regression models obtained were significant at a confidence level of 95%.O presente trabalho visou o estudo do efeito de diferentes variáveis na produção de β-1,3 glucanases, proteases e de quitinases pela linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191, em meios de cultivo A, B e C, respectivamente. Foram realizados planejamentos fatoriais 2³, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de β-1,3 glucanase em meio de cultivo A foi verificada maior produção da enzima (0,64 U.mL-1) com pH inicial de 8,5 após 24 horas de fermentação a 33 ºC e 200 rpm. Os parâmetros pH, agitação dos frascos e interação entre todos os parâmetros foram estatisticamente significativos. No planejamento experimental para a produção de protease em meio de cultivo B foi verificada maior produção da enzima (4,25 U.mL-1) com pH inicial de 6,5 após 30 horas de fermentação a 20 ºC e 200 rpm. O pH foi o único parâmetro estatisticamente significativo. No planejamento experimental para a produção de quitinase em meio de cultivo C foi verificada maior produção da enzima (7,06 U.mL-1) com pH inicial de 5,5 após 72 horas de fermentação a 25 ºC e 200 rpm. Todos os parâmetros estudados e suas interações foram estatisticamente significativos. Os coeficientes de determinação, as análises de variância e os teste F demonstraram que os modelos de primeira ordem obtidos foram considerados estatisticamente significativos adotando um nível de confiança de 95%.299310Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Influence of sanitation on the physico-chemical and microbiological quality of organic and conventional broccoli

The present study was carried out in order to evaluate the effect of chlorinated and ozonized water on the physico-chemical characteristics of broccoli, produced under organic and conventional cultivation procedures. Organic and conventional broccolis were subjected to two sanitation treatments, using chlorine and ozone, and were kept under cold storage for seven days. Analyses of pH, titrable acidity, soluble solids and weight loss were performed and the content of Cu, Mn and Zn was determined. In addition, the presence of pesticides was verified. The results show no influence of the cultivation method or the sanitation treatment on sample weight loss. Cultivation methods and sanitizing treatments affected broccoli pH, titratable acidity, and soluble solids during the evaluation period. No differences regarding the metal content on organic and conventional broccoli were observed. Furthermore, the presence of organochlorine compounds, nor other pesticides, was not detected both in organic and conventional vegetables.Keywords: Brassica oleracea var. Italica, pesticide residues, titrable acidity, soluble solids, pH, metals, ozone, sanitation treatment African Journal of Biotechnology Vol. 12(18), pp. 2456-246

Beta-1,3 glucanases, protease and chitinases : production, purification and application

Orientador: Helia Harumi SatoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O presente trabalho visou o estudo da produção, purificação e aplicação de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases. A linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 foi utilizada para o estudo da produção de b-1,3 glucanases e quitinases e as linhagens B26 e C. cellulans 191 foram utilizadas para a produção de proteases, em meios de cultivo contendo diferentes indutores. Foram realizados planejamentos fatorias 23, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura (oC) e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de b-1,3 glucanase foi verificado maior produção da enzima (0,64 U/mL) em meio de cultivo A composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 10 g/L de parede celular de levedura em tampão fosfato 0,2 M, pH 8,5, após 24 h de fermentação, a 33oC e 200 rpm. Nos planejamentos experimentais para a produção de protease pelas linhagens B26 e 191 foi verificado maior produção da enzima em meio de cultivo B composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 80 g/L de levedura seca utilizada como indutor em tampão fosfato 0,15 M, pH 6,5, após 30 h de fermentação a 20oC e 200 rpm, sendo obtido 5,01 U/mL e 4,25 U/mL, respectivamente. No planejamento experimental para a produção de quitinase foi verificado maior produção da enzima (7,06 U/mL) em meio de cultivo C composto por 4,0 g/L de extrato de levedura; 2,0 g/L de triptona; 4,0 g/L de MgSO4.7H2O; 1,2 g/L de KH2PO4; 2,8 g/L de K2HPO4 e 15 g/L de quitina neutralizada utilizada como indutor, com pH inicial de 5,5 após 72 h de fermentação a 25oC e 200 rpm. Todos os modelos obtidos foram preditivos e significativos a um nível de confiança de 95%. No estudo de produção das enzimas da linhagem C. cellulans 191 em fermentador de 5 L, a maior produção de b-1,3 glucanase, utilizando meio de cultivo A e 1,5 vvm e 3 vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72 U/mL, após 24 h de fermentação a 30oC. Na produção de protease em fermentador de 5 L, utilizando meio de cultivo B e 1,5 vvm foi obtido 1,87 U/mL e 2,34 U/mL, respectivamente, após 6 h e 30 h de fermentação a 30oC; enquanto que com 3 vvm, foi obtido 4,89 U/mL e 6,14 U/mL de protease após 6 h e 33 h de fermentação, a 30oC. Em fermentador de 5 L, a maior produção de quitinase em meio de cultivo C foi de 4,19 U/mL com 1,5 vvm após 168 h de fermentação e 4,38 U/mL de quitinase após 144 h de fermentação com 3 vvm, a 25oC. No estudo de produção de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases da linhagem C. cellulans 191 em frascos agitados, em meios de cultivo A, B e C, foram produzidos respectivamente, 1,12 U/mL de b-1,3 glucanase; 4,2 U/mL de protease e 6,9 U/mL de quitinase. A b-1,3 glucanase (45 KDa) foi purificada 11,83 vezes com rendimento de 25% em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50. Na purificação das proteases em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50 foram obtidas três frações de proteases denominadas P1, P2 e P3. A fração P3 apresentou duas bandas de massas moleculares de 14 e 16 KDa em eletroforese SDS-PAGE. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes com rendimento de 46,61% em resina de filtração em gel Sepharose CL4B200. A b-1,3 glucanase purificada apresentou atividade de lise de diversas leveduras e foi capaz de formar protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae KL-88. O pré-tratamento das leveduras com protease P3 purificada não aumentou a lise das leveduras com a ß-1,3 glucanase. A quitinase purificada foi capaz de lisar células de algumas espécies de fungos em suspensão aquosa, mas não foi capaz de inibir, o crescimento dos fungos em placas de ágar batata dextrose. A preparação bruta de quitinase apresentou halo de inibição do crescimento de alguns fungos estudados. Os produtos formados pela reação da b-1,3 glucanase purificada sobre a laminarina e da protease purificada sobre a levedura seca apresentaram capacidade antioxidanteAbstract: The aim of this work was to study the production, purification and application of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases. The strain Cellulosimicrobium cellulans 191 was used to study the production of b-1,3 glucanases and chitinases and strains B26 and C. cellulans 191 for the production of proteases, using culture media containing different inductors. 23 factorial experimental designs were performed and the factors studied were: initial pH, temperature (oC) and flask rotatory speed. In the experimental design for the production of b-1,3 glucanase, greater enzyme production (0.64 U/mL) was obtained in culture medium A containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O and 10 g/L cell wall yeast in 0.2 M phosphate buffer, pH 8.5, after 24 h of fermentation at 33oC and 200 rpm. In the experimental design for the production of protease by strains B26 and 191, greater enzyme production was obtained in culture medium B containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L de MgSO4.7H2O and 80 g/L dry yeast in 0.15 M phosphate buffer, pH 6.5, after 30 h of fermentation at 20oC and 200 rpm, with yields of 5.01 U/mL and 4.25 U/mL, respectively. In the experimental design for the production of chitinase, greater enzyme production (7.06 U/mL) was obtained in culture medium C containing 4.0 g/L yeast extract; 2.0 g/L tryptone; 4.0 g/L MgSO4.7H2O; 1.2 g/L KH2PO4; 2.8 g/L K2HPO4 and 15 g/L of neutralized chitin with an initial pH of 5.5, after 72 h of fermentation at 25oC and 200 rpm. All models obtained were predictive and significant at a confidence level of 95%. In the study on the production of enzymes from C. cellulans strain 191 in a 5 L fermenter, the highest productions of b-1,3 glucanase in medium A with 1.5 vvm and 3.0 vvm were 0.32 U/mL and 0.72 U/mL respectively, after 24 h of fermentation at 30oC. In the production of protease in a 5 L fermenter using culture medium B and 1.5 vvm, 1.87 U/mL and 2.34 U/mL were obtained after 6 h and 30 h respectively of fermentation at 30oC, whilst with 3 vvm, 4.89 U/mL and 6.14 U/mL of protease were obtained after 6 h and 33 h respectively of fermentation at 30oC. In a 5 L fermenter, the highest production of chitinase from C. cellulans strain 191 using 1.5 vvm was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation, whilst with 3 vvm, the production was 4.38 U/mL of chitinase after 144 h of fermentation at 25oC. In the study on the production of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases from C. cellulans strain 191 in shaken flasks and culture media A, B and C, 1.12 U/mL of b-1,3 glucanase; 4.2 U/mL of protease and 6.9 U/mL of chitinase were produced respectively. In the purification study, the b-1,3 glucanase (45 KDa) was purified 11.83 times with a yield of 25% using a DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin. In the purification of the proteases using the DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin, three protease fractions were obtained named P1, P2 and P3. Fraction P3 presented two proteins with molecular weights of 14 and 16 KDa in SDS-PAGE electrophoresis. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times with a yield of 46.61% in a Sepharose CL4B200 gel filtration resin. The purified b-1,3 glucanase presented lysis activity against several yeasts and was able to form protoplasts from the Saccharomyces cerevisiae KL-88 yeast. Pre-treatment of the yeasts with the purified protease P3 did not increase cell lysis by the b-1,3 glucanase. The purified chitinase was able to lyse the cell walls of some fungal species in aqueous suspension, but was not able to inhibit the growth of these fungi on potato dextrose agar plates. The crude chitinase preparation presented growth inhibition halos for some of the fungi studied. The products formed from the reaction between the purified b-1,3 glucanase and laminarin and between the purified protease and the dry yeast presented antioxidant powerDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento

Produção, purificação, clonagem e aplicação de enzimas líticas Production, purification, cloning and application of lytic enzymes

<abstract language="eng">Lytic enzymes such as beta-1,3 glucanases, proteases and chitinases are able to hydrolyse, respectively, beta-1,3 glucans, mannoproteins and chitin, as well as the cell walls of many yeast species. Lytic enzymes are useful in a great variety of applications including the preparation of protoplasts; the extraction of proteins, enzymes, pigments and functional carbohydrates; pre-treatment for the mechanical rupture of cells; degradation of residual yeast cell mass for the preparation of animal feed; analysis of the yeast cell wall structure and composition; study of the yeast cell wall synthesis and the control of pathogenic fungi. This review presents the most important aspects with respect to lytic enzymes, especially their production, purification, cloning and application

&#946;-1,3 Glucanases e quitinases: aplicação na lise de leveduras e inibição de fungos &#946;-1,3 glucanases and chitinases: application in the yeast cell lysis and fungi inhibition

Objetivou-se, no presente trabalho, a aplicação de &#946;-1,3 glucanases e quitinases da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 na lise de leveduras e inibição de fungos, respectivamente. O delineamento experimental mostrou que as melhores condições para a lise de Saccharomyces cerevisiae KL-88 pela &#946;-1,3 glucanase foi pH 6,5 e 35ºC. As células de leveduras incubadas por 10 h em frascos sem agitação mostraram-se mais susceptíveis à lise pela ação da enzima. Foi obtido maior lise da levedura quando a suspensão de células foi submetida ao tratamento com &#946;-1,3 glucanase e cisteína 1mM. A enzima invertase intracelular ou ligada à célula de S. cerevisiae KL-88 e K. marxianus NCYC 587 foi extraída após tratamento da suspensão celular com &#946;-1,3 glucanase, sendo que o tratamento prévio das leveduras com a enzima aumentou a susceptibilidade das células à lise com ultra-som. A preparação de quitinase foi capaz de formar halos de inibição de alguns fungos.<br>The aim of this work was the application of &#946;-1,3 glucanases and chitinases by Cellulosimicrobium cellulans 191 strain on yeast cell lysis and fungi inhibition, respectively. The experimental design study showed that the best conditions to Saccharomyces cerevisiae KL-88 lysis by &#946;-1,3 glucanase extract were pH 6,5 and 35ºC. This study also demonstrated that the yeast cells were more susceptible to lysis after 10 h of cultivation in flasks without agitation. Lysis activity was increased when S. cerevisiae KL-88 cell suspension was treated with &#946;-1,3 glucanase and cystein 1mM. The enzyme invertase of S. cerevisiae KL-88 and Kluyveromyces marxianus NCYC 587 was extracted after treatment of cell suspension with &#946;-1,3 glucanase and the previous treatment of yeasts with the enzyme, increased the susceptibility to lysis when ultrasonic treatment was used. The chitinase presented growth inhibition halos for some of the fungi

Protoplasts production and yeast cell wall lysis usingβ-1,3 glucanase

The aim of this work was the application of lytic β-1,3 glucanase obtained from Cellulosimicrobium cellulans strain 191 in the production of protoplasts and lysis of yeast cell walls. The crude extract demonstrated lysis activity against the yeasts Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann and Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587, and Hansenula mrakii NCYC 500. The purified β-1,3 glucanase demonstrated lysis activity against the yeasts Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii, and Pichia membranaefaciens, and it was able to produce Saccharomyces cerevisiae KL-88 protoplasts.O presente trabalho visou a aplicação da β-1,3 glucanase lítica, obtida do microrganismo Cellulosimicrobium cellulans 191, na produção de protoplastos e na lise da parede celular de leveduras. A preparação bruta da enzima foi capaz de lisar as leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann e Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. A β;-1,3 glucanase purificada foi capaz de lisar as leveduras Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii e Pichia membranaefaciens e formar protoplastos de Saccharomyces cerevisiae KL-88.47147