A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Brain capillary endothelial cells (BCECs) form the physiological basis of the blood-brain barrier (BBB). The barrier function is (at least in part) due to well-known proteins such as transporters, tight junctions and metabolic barrier proteins (e.g. monoamine oxidase, gamma glutamyltranspeptidase and P-glycoprotein). Our previous 2-dimensional gel proteome analysis had identified a large number of proteins and revealed the major role of dynamic cytoskeletal remodelling in the differentiation of bovine BCECs. The aim of the present study was to elaborate a reference proteome of Triton X-100-soluble species from bovine BCECs cultured in the well-established <it>in vitro </it>BBB model developed in our laboratory.</p> <p>Results</p> <p>A total of 215 protein spots (corresponding to 130 distinct proteins) were identified by 2-dimensional gel electrophoresis, whereas over 350 proteins were identified by a shotgun approach. We classified around 430 distinct proteins expressed by bovine BCECs. Our large-scale gene expression analysis enabled the correction of mistakes referenced into protein databases (e.g. bovine vinculin) and constitutes valuable evidence for predictions based on genome annotation.</p> <p>Conclusions</p> <p>Elaboration of a reference proteome constitutes the first step in creating a gene expression database dedicated to capillary endothelial cells displaying BBB characteristics. It improves of our knowledge of the BBB and the key proteins in cell structures, cytoskeleton organization, metabolism, detoxification and drug resistance. Moreover, our results emphasize the need for both appropriate experimental design and correct interpretation of proteome datasets.</p

Abstracts from the 20th International Symposium on Signal Transduction at the Blood-Brain Barriers

https://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/138963/1/12987_2017_Article_71.pd

Transcytose à travers la barrière hémato-encéphalique (étude in vitro du transport des lipoproteines de basse densité et du peptide ß-amyloïde)

La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L expression de ces propriétés est induite par l environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides b-amyloïde (Ab) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d être à l origine de l accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l implication du récepteur receptor for advanced glycation end-products (RAGE) dans l entrée vers le compartiment cérébral des peptides Ab. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L implication de pompes d efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la breast cancer resistance protein (BCRP) dans la restriction de l influx des peptides Ab a également été mise en évidence. D autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur low density lipoprotein receptor-related 1 (LRP1) n est pas impliqué dans l efflux des peptides Ab. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d envisager de nouvelles approches thérapeutiques.The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid b (Ab) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Ab peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that low density lipoprotein receptor related-1 (LRP1) is not involved in the efflux of Ab peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.ARRAS-Bib.electronique (620419901) / SudocSudocFranceF

Protein transport in cerebral endothelium

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La barrière hémato-encéphalique et l'ischémie cérébrale (étude in vitro de la dysfonction et de la protection microvasculaire)

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux. Elle présente des caractéristiques physiques et métaboliques spécifiques restreignant les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l homéostasie du système nerveux central. Dans des conditions pathologiques comme l ischémie cérébrale, la perte de son intégrité provoque l apparition d un oedème vasogénique qui aggrave considérablement le pronostic vital des patients. Malheureusement, les mécanismes impliqués dans l hyperperméabilité vasculaire demeurent inconnus, ce qui limite l utilisation de la seule thérapie disponible à 5% des patients. Depuis qu aucun agent pharmacologique n a réussit à être neuroprotecteur, notre compréhension des rapports entre le sang et le cerveau est remise en cause. La complexité des interactions entre la BHE et les cellules nerveuses a mené au concept d une unité fonctionnelle dite neurovasculaire. Ainsi de nouvelles stratégies de protection émergent à partir d observations au niveau vasculaire. Ainsi la première partie de nos travaux a consisté à étudier l effet vasculoprotecteur potentiel du fénofibrate, un hypolipémiant agoniste du récepteur nucléaire PPAR-a (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor-alpha), dont le bénéfice est observé en clinique depuis quelques années et plus récemment dans une étude expérimentale menée chez la souris. Les mécanismes de cette protection aujourd hui inconnus, pourraient impliquer la BHE réputée très peu perméable à ce fibrate. Un renforcement de la BHE limiterait la formation de l oedème cérébral. Pour cela nous avons adapté un modèle in vitro syngénique murin de BHE aux études de perméabilité en condition d OGD (oxygen and glucose deprivation) mimant les conséquences immédiates de l occlusion, toute première étape de l accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Le modèle consiste en une co-culture de cellules endothéliales primaires de capillaires cérébraux et de cellules gliales primaires. Nos travaux démontrent qu un traitement préventif au fénofibrate protège l endothélium en limitant l hyperperméabilité induite par l OGD. Cette action protectrice cible exclusivement l endothélium et dépend de l activation de PPAR-a démontré par l absence d effet protecteur sur les cellules endothéliales dont le gène codant pour PPAR-a a été invalidé. La seconde partie de l étude s est intéressée aux dommages vasculaires de la reperfusion, étape plus tardive de l ischémie cérébrale connue pour aggraver l oedème vasogénique et mener à des hémorragies fatales. A l aide de notre modèle in vitro, nous avons étudié l effet de la réoxygénation sur la perméabilité vasculaire dans le but de se rapprocher des conditions ischémiques in vivo. Après une incubation en condition d OGD, la co-culture est replacée dans un milieu réoxygéné pendant une période allant de 2h à 24h. La mesure de la perméabilité vasculaire a démontré un profil multiphasique de l ouverture de la BHE dépendant de la présence des cellules gliales. L analyse en microscopie électronique des cellules endothéliales a suggéré une modulation fine de la fonctionnalité des jonctions serrées endothéliales. De plus, l étude en IRM de diffusion chez la souris in vivo a révélé des mouvements d eau qui suggèrent une perturbation de l homéostasie hydrique du parenchyme cérébral au voisinage de l occlusion dans les étapes précoces mais aussi dans les étapes tardives. En conclusion, l ensemble des travaux met en avant la possibilité d une préservation pharmacologique de l intégrité de la BHE au début de l ischémie cérébrale. Celle-ci montre l intérêt des approches in vitro utilisant un modèle cellulaire pertinent et caractérisé. La validation de la cible cellulaire et moléculaire du fénofibrate à l aide de notre modèle ouvre une première voie d exploration des mécanismes impliqués dans ce phénomène de protection microvasculaire précoce. Cependant, la dysfonction retardée de la BHE est également un élément à prendre en compte pour se rapprocher de la physiopathologie de l ischémie in vivo et espérer à terme une amélioration de l approche thérapeutique de cette pathologie.The Blood brain barrier (BBB) is an interface localised at brain capillary endothelial cells. The BBB possesses both physical and metabolic restrictive properties aiming at the maintenance of the central nervous system homeostasis. But under pathological conditions like ischemic stroke, the loss of BBB integrity induces a cerebral vasogenic edema which considerably worsens the vital prognosis of patients. The mechanisms underlying this vascular hyperpermeability are currently unknown thus limiting the use of the only medical intervention available at only 5% of stroke patients. Since no pharmacological molecule succeeded in being neuroprotective, our understanding of the relationships between blood and brain is questioned. The complex interactions between the BBB and nervous cells have lead to the concept of a functional unit, termed the neurovascular unit. Thus, new strategies are recently emerging from observation of vascular events. Thus, the first aim of our study was to test the potential vasculoprotective action of fenofibrate, a hypolipemic drug known as an activator of the nuclear receptor PPAR-a a (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha), as benefit against stroke was observed in clinics since a few years, and recently reported in an experimental study. Yet unknown mechanisms, the protective effect may be exerted on the BBB since reported as impermeable to this compound. An early tightening of the BBB would limit the extent of brain edema. Hence, we have adapted a mouse syngenic BBB in vitro cell model to permeability studies under the stress condition found at the early stage of ischemic stroke defined in vitro as oxygen and glucose deprivation (OGD). This stress simulates the early consequences of occlusion. This model consists of a co-culture of primary brain capillary endothelial cells together with primary glial cells. We have demonstrated that a preventive treatment with fenofibrate has a protective effect on the BBB by limiting the hyperpermeability induced by the OGD condition. This effect targets endothelial cells exclusively and depends on PPAR-a activation, as revealed by the absence of protective action of fenofibrate on PPAR-a deficient endothelial cells. The second part of the study has focused on vascular reperfusion injury, a later stage of ischemia known to worsen vasogenic oedema and to lead to fatal haemorrhage. Using our in vitro BBB model, we have studied the effect of reoxygenation on vascular permeability in order to closely simulate in vivo ischemic condition. Following incubation under OGD condition, the co-cultures were placed into an oxygenated culture medium from 2h to 24h. The BBB permeability demonstrated a multiphasic opening of the BBB which depended on glial cells presence. Electronic microscopy analysis of BBB endothelial cells suggested a fine modulation of tight junction functionality. Moreover, the MRI diffusion analysis in mice has revealed particular water movements suggesting an early disturbance in water homeostasis of brain parenchyma in the vicinity of occlusion. In conclusion, this work put forward the idea of a pharmacological BBB protection at the early stage of ischemic stroke. This demonstrates the relevance of in vitro approaches using a pertinent and well characterised cell model. The validation of cellular and molecular targets of fenofibrate opens a way of first exploration of mechanisms involved in this early microvascular protection phenomenon. But the late BBB dysfunction also needs to be taken into account for a complete fitting with in vivo stroke pathophysiology and an improvement of the therapeutic approaches to this pathology.ARRAS-Bib.electronique (620419901) / SudocSudocFranceF

Effects of oxysterols on the blood–brain barrier: Implications for Alzheimer’s disease

International audienceAltered brain cholesterol homeostasis plays a key role in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD). For a long time, the blood-brain barrier (BBB) was basically considered as a barrier isolating the brain from circulating cholesterol, however, several lines of evidence now suggest that the BBB strictly regulates the exchanges of sterol between the brain and the peripheral circulation. Oxysterols, synthesized by neurons or by peripheral cells, cross the BBB easily and modulate the expression of several enzymes, receptors and transporters which are involved not only in cholesterol metabolism but also in other brain functions. This review article deals with the way oxysterols impact BBB cells. These perspectives open new routes for designing certain therapeutical approaches that target the BBB so that the onset and/or progression of brain diseases such as AD may be modulated

La barrière hémato-encéphalique

Le cerveau est isolé du reste de l’organisme par la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui contrôle étroitement les échanges entre les compartiments sanguin et cérébral. En raison de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie cérébrale, cette barrière est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer (MA) dont l’origine est attribuée à l’accumulation et l’agrégation excessives de peptides Aβ. Le rôle de la BHE dans le métabolisme et le transport de ces peptides est aujourd’hui étudié avec plus d’attention et les premiers résultats obtenus permettent d’affirmer sans ambiguïté que cette barrière est un acteur majeur de cette pathologie complexe et suggèrent qu’elle pourrait être une nouvelle cible thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer

The LXR/RXR Approaches in Alzheimer’s Disease: Is the Blood-Bra in Barrier the Forgotten Partner?

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The Blood–Brain Barrier, an Evolving Concept Based on Technological Advances and Cell–Cell Communications

International audienceThe construction of the blood–brain barrier (BBB), which is a natural barrier for maintaining brain homeostasis, is the result of a meticulous organisation in space and time of cell–cell communication processes between the endothelial cells that carry the BBB phenotype, the brain pericytes, the glial cells (mainly the astrocytes), and the neurons. The importance of these communications for the establishment, maturation and maintenance of this unique phenotype had already been suggested in the pioneering work to identify and demonstrate the BBB. As for the history of the BBB, the evolution of analytical techniques has allowed knowledge to evolve on the cell–cell communication pathways involved, as well as on the role played by the cells constituting the neurovascular unit in the maintenance of the BBB phenotype, and more particularly the brain pericytes. This review summarises the key points of the history of the BBB, from its origin to the current knowledge of its physiology, as well as the cell–cell communication pathways identified so far during its development, maintenance, and pathophysiological alteration

Transfert cérébral et neuroprotection

Les cellules endothéliales de capillaires cérébraux, support anatomique de la barrière hémato-encéphalique, présentent des caractéristiques structurales et métaboliques qui restreignent considérablement les échanges entre le sang et le parenchyme cérébral. Nécessaire au maintien de l'homéostasie du système nerveux central, ce filtre sélectif reste un problème pour le traitement des maladies cérébrales. Afin de recréer les interactions qui existent in vivo et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le passage des molécules vers cerveau, nous avons établi un modèle de barrière hémato-encéphalique in vitro. Ce modèle consiste en coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales ensemencées de part et d'autre d'un filtre. Dans ces conditions de culture, nous avons démontré que les cellules endothéliales exprimaient toutes les caractéristiques, tant physiques que métaboliques, de l'endothélium in vivo. Ces résultats font de notre modèle un outil pertinent et précieux dans le développement de nouvelles molécules à visée cérébrale