Editorial:4th Applied Synthetic Biology in Europe

International audienc

APE1 overexpression in XRCC1-deficient cells complements the defective repair of oxidative single strand breaks but increases genomic instability

XRCC1 protein is essential for mammalian viability and is required for the efficient repair of single strand breaks (SSBs) and damaged bases in DNA. XRCC1-deficient cells are genetically unstable and sensitive to DNA damaging agents. XRCC1 has no known enzymatic activity and is thought to act as a scaffold protein for both SSB and base excision repair activities. To further define the defects leading to genetic instability in XRCC1-deficient cells, we overexpressed the AP endonuclease APE1, shown previously to interact with and be stimulated by XRCC1. Here, we report that the overexpression of APE1 can compensate for the impaired capability of XRCC1-deficient cells to repair SSBs induced by oxidative DNA damage, both in vivo and in whole-cell extracts. We show that, for this kind of damage, the repair of blocked DNA ends is rate limiting and can be performed by APE1. Conversely, APE1 overproduction resulted in a 3-fold increase in the sensitivity of XRCC1-deficient cells to an alkylating agent, most probably due to the accumulation of SSBs. Finally, the overproduction of APE1 results in increases of 40% in the frequency of micronuclei and 33% in sister chromatid exchanges of XRCC1(−) cells. These data suggest that the spontaneous generation of AP sites could be at the origin of the SSBs responsible for the spontaneous genetic instability characteristic of XRCC1-deficient cells

Production of medium chain fatty acid by Yarrowia lipolytica: Combining molecular design and TALEN to engineer the fatty acid synthase

Yarrowia lipolytica is a promising organism for the production of lipids of biotechnological interest and particularly for biofuel. In this study, we engineered lipid biosynthesis through rational engineering of the giant multifunctional Fatty Acid Synthase (FAS) enzyme to modulate fatty acid chain length and produce shorter fatty acids. Based on the hypothesis that the Ketoacyl Synthase (KS) domain, responsible for chain elongation in Yarrowia lipolytica, is directly involved in chain length specificity, a computer-based strategy was undertaken to re-design mutants of the Ketoacyl Synthase. Molecular modelling of this domain in interaction with a C16-acyl substrate enabled identification of a key residue from the fatty acid binding site. This site was then targeted by mutagenesis in order to modify KS fatty acid chain length specificity. To introduce point mutations in this essential gene, we applied, for the first time, the TALEN technology to Yarrowia lipolytica and demonstrated the efficiency of the technique to perform site-directed mutagenesis at a specific genomic locus. Some mutants led to a significant increase of C14 fatty acid. Thanks to the use of an elegant combination of genome editing technology and molecular modelling, this study provides for the first time, evidences that the KS domain of the fungal FASI system is directly involved in fatty acid chain length specificity

Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease

Sequence-specific endonucleases recognizing long target sequences are emerging as powerful tools for genome engineering. These endonucleases could be used to correct deleterious mutations or to inactivate viruses, in a new approach to molecular medicine. However, such applications are highly demanding in terms of safety. Mutations in the human RAG1 gene cause severe combined immunodeficiency (SCID). Using the I-CreI dimeric LAGLIDADG meganuclease as a scaffold, we describe here the engineering of a series of endonucleases cleaving the human RAG1 gene, including obligate heterodimers and single-chain molecules. We show that a novel single-chain design, in which two different monomers are linked to form a single molecule, can induce high levels of recombination while safeguarding more effectively against potential genotoxicity. We provide here the first demonstration that an engineered meganuclease can induce targeted recombination at an endogenous locus in up to 6% of transfected human cells. These properties rank this new generation of endonucleases among the best molecular scissors available for genome surgery strategies, potentially avoiding the deleterious effects of previous gene therapy approaches

Molecular basis of engineered meganuclease targeting of the endogenous human RAG1 locus

Homing endonucleases recognize long target DNA sequences generating an accurate double-strand break that promotes gene targeting through homologous recombination. We have modified the homodimeric I-CreI endonuclease through protein engineering to target a specific DNA sequence within the human RAG1 gene. Mutations in RAG1 produce severe combined immunodeficiency (SCID), a monogenic disease leading to defective immune response in the individuals, leaving them vulnerable to infectious diseases. The structures of two engineered heterodimeric variants and one single-chain variant of I-CreI, in complex with a 24-bp oligonucleotide of the human RAG1 gene sequence, show how the DNA binding is achieved through interactions in the major groove. In addition, the introduction of the G19S mutation in the neighborhood of the catalytic site lowers the reaction energy barrier for DNA cleavage without compromising DNA recognition. Gene-targeting experiments in human cell lines show that the designed single-chain molecule preserves its in vivo activity with higher specificity, further enhanced by the G19S mutation. This is the first time that an engineered meganuclease variant targets the human RAG1 locus by stimulating homologous recombination in human cell lines up to 265 bp away from the cleavage site. Our analysis illustrates the key features for à la carte procedure in protein–DNA recognition design, opening new possibilities for SCID patients whose illness can be treated ex vivo

Advances in editing microalgae genomes

There have been significant advances in microalgal genomics over the last decade. Nevertheless, there are still insufficient tools for the manipulation of microalgae genomes and the development of microalgae as industrial biofactories. Several research groups have recently contributed to progress by demonstrating that particular nucleases can be used for targeted and stable modifications of the genomes of some microalgae species. The nucleases include Meganucleases, Zinc Finger nucleases, TALE nucleases and, as shown most recently, the CRISPR/Cas9 system. These molecular editing tools allow gene knock-out and gene knock-in manipulations and the introduction of enzyme variants; they will facilitate the study of microalgae and in particular gene function and, thereby favoring exploitation of the metabolic potential of microalgae

Bioraffinerie environnementale et les usages en cascade de la biomasse

La biomasse lignocellulosique est reconnue comme étant la ressource renouvelable la plus abondante de notre planète et dans ce sens elle est de plus en plus sollicitée pour faire face aux demandes de la bio-économie. Les demandes d'une population mondiale en augmentation constante ne pourront jamais être satisfaites si cette ressource essentielle n'est pas utilisée de manière plus efficace et durable, avec des étapes séquentielles d'utilisations massiques. La fréquence et l'efficacité de ces étapes doivent ensuite être maximisées, l'étape finale (de récupération d'énergie) se produisant à la toute fin du cycle de vie du produit. Ce principe est appelé utilisation en cascade. Cette hiérarchisation des usages dirige la biomasse tout d’abord vers des utilisations matière à haute valeur ajoutée plutôt que vers une valorisation énergie seule (combustion, incinération). L’utilisation en cascade peut jouer un rôle essentiel dans le développement de l’économie circulaire, néanmoins cette stratégie de valorisation n’est pas encore très répandue en raison de certains obstacles comme : l’approvisionnement durable des ressources ; certains verrous technologiques (prétraitements, procédés de séparation, etc.) ; le manque d’approche intégrée promouvant l’application énergétique et massique de la biomasse ; le manque d’entente entre les différents acteurs d’une même filière, etc. L’implémentation des usages en cascade de la biomasse suppose un challenge technique important de par les changements dans la structure et fonctionnement de tous les secteurs concernés. Pour qu’une telle stratégie puisse être déployée au niveau national et/ou Européen, des connexions entre les différents secteurs doivent être établies afin de faciliter le transfert des produits, coproduits et déchets entre les différents secteurs impliquées dans la filière. Egalement, des actions de R&D doivent être menées afin de mieux appréhender les impacts environnementaux et économiques de l’utilisation en cascade de la biomasse dans l’industrie. Dans un contexte économique incertain de certains secteurs de l’industrie agroalimentaire, l’utilisation de la biomasse en cascade pourrait aussi aider à la création de nouvelles activités, afin de multiplier les sources de revenu pour assurer un niveau d’efficience économique et maintenir les emplois

Relations épistatiques entre RAD51 et ses paralogues chez les mammifères (étude de la sensibilité aux stress génotoxiques, la recombinaison homologue, la duplication des centrosomes et la réplication)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Genetic and metabolic engineering in diatoms

Diatoms have attracted considerable attention due to their success in diverse environmental conditions, which probably is a consequence of their complex origins. Studies of their metabolism will provide insight into their adaptation capacity and are a prerequisite for metabolic engineering. Several years of investigation have led to the development of the genome engineering tools required for such studies, and a profusion of appropriate tools is now available for exploring and exploiting the metabolism of these organisms. Diatoms are highly prized in industrial biotechnology, due to both their richness in natural lipids and carotenoids and their ability to produce recombinant proteins, of considerable value in diverse markets. This review provides an overview of recent advances in genetic engineering methods for diatoms, from the development of gene expression cassettes and gene delivery methods, to cutting-edge genome-editing technologies. It also highlights the contributions of these rapid developments to both basic and applied research: they have improved our understanding of key physiological processes; and theyhave made it possible to modify the natural metabolism to favour the production of specific compounds or to produce new compounds for green chemistry and pharmaceutical applications.This article is part of the themed issue ‘The peculiar carbon metabolism in diatoms’

Bioraffinerie environnementale et les usages en cascade de la biomasse

La biomasse lignocellulosique est reconnue comme étant la ressource renouvelable la plus abondantede notre planète et dans ce sens elle est de plus en plus sollicitée pour faire face aux demandes de labio-économie. Les demandes d'une population mondiale en augmentation constante ne pourront jamaisêtre satisfaites si cette ressource essentielle n'est pas utilisée de manière plus efficace et durable, avecdes étapes séquentielles d'utilisations massiques. La fréquence et l'efficacité de ces étapes doiventensuite être maximisées, l'étape finale (de récupération d'énergie) se produisant à la toute fin du cyclede vie du produit. Ce principe est appelé utilisation en cascade. Cette hiérarchisation des usagesdirige la biomasse tout d’abord vers des utilisations matière à haute valeur ajoutée plutôt que vers unevalorisation énergie seule (combustion, incinération). L’utilisation en cascade peut jouer un rôleessentiel dans le développement de l’économie circulaire, néanmoins cette stratégie de valorisationn’est pas encore très répandue en raison de certains obstacles comme : l’approvisionnement durabledes ressources ; certains verrous technologiques (prétraitements, procédés de séparation, etc.) ; lemanque d’approche intégrée promouvant l’application énergétique et massique de la biomasse ; lemanque d’entente entre les différents acteurs d’une même filière, etc. L’implémentation des usages encascade de la biomasse suppose un challenge technique important de par les changements dans lastructure et fonctionnement de tous les secteurs concernés. Pour qu’une telle stratégie puisse êtredéployée au niveau national et/ou Européen, des connexions entre les différents secteurs doivent êtreétablies afin de faciliter le transfert des produits, coproduits et déchets entre les différents secteursimpliquées dans la filière. Egalement, des actions de R&D doivent être menées afin de mieuxappréhender les impacts environnementaux et économiques de l’utilisation en cascade de la biomassedans l’industrie. Dans un contexte économique incertain de certains secteurs de l’industrie agroalimentaire,l’utilisation de la biomasse en cascade pourrait aussi aider à la création de nouvellesactivités, afin de multiplier les sources de revenu pour assurer un niveau d’efficience économique etmaintenir les emplois