Checkpoint de réplication et instabilité génomique chez la levure Schizosaccharomyces pombe et leur éventuelle implication dans le cancer du sein

Au cours de la réplication, la synthèse d'ADN est coordonnée avec la progression du cycle cellulaire par l'action de systèmes de contrôle (checkpoints) qui vérifient le déroulement correct de la réplication. Lorsque plusieurs fourches de réplication s'arrêtent, le checkpoint de réplication est activé ce qui permet le redémarrage correct des fourches une fois la cause de l'arrêt de la synthèse éliminé. L'hydroxyurée (HU) inhibe l'activité de la ribonucléotide réductase et dérégule la concentration de désoxyribonucléotides triphosphate. Ceci provoque un ralentissement drastique de la progression des fOUfches de réplication dans une souche sauvage de S. pombe. Ce ralentissement active la protéine Cds1, kinase centrale du checkpoint de réplication. Dans une première étude, j'ai montré qu'en présence d'HU, le checkpoint de réplication prévient la fragmentation de l'ADN spécifique de la phase S et dépendante de l'endonucléase Mus81. En cas de stress réplicatif, le checkpoint de la réplication protège la fourche de réplication et participe ainsi au maintien de la stabilité génomique. Dans une seconde étude, je me suis attaché à comprendre l'implication de ces protéines de checkpoints et de réparation des dommages de l'ADN dans la genèse de cellules souches tumorales chimiorésistantes. Cette étude a été menée en utilisant un modèle de xénogreffe de tumeurs de sein de type basal-like. Mon travail a tout d'abord consisté à la mise en place des outils nécessaires à l'isolement et à la caractérisation des cellules souches aussi bien au niveau génomique que transcriptomique. Les premiers résultats expérimentaux sont en cours d'analyse.During replication, DNA synthesis is coordinated to cell cycle progression through the action of checkpoints. When several replication forks are blocked, the replication checkpoint is activated and blocks cell cycle until replicative stress disappears allowing proper replication forks restart. Hydroxyurea (HU) inhibits the activity of ribonucleotide reductase and decreases the pool of triphosphate deoxyribonucleotides. This leads to a drastic slow down of the progression of replication forks in a wild type strain of S. pombe. This delay activates Cds1, the central kinase of the replication checkpoint. ln the first part of my thesis, 1 have shown that, in presence of HU, the replication checkpoint prevents S-phase specific and Mus811dependent DNA fragmentation. Under replicative stress, the replication checkpoint protects replication fork and therefore participates to the maintenance of genomic stability. The aim of the second part was to elucidate the implication of checkpoint and DNA repair proteins in the emergence of tumor stem cells. The well-characterized model of xenograft of basal-like breast tumors was used. 1 first established the technical tools required for the isolation of tumor stem cells and their characterisation at the genomic and transcriptionallevels. The first experimental results are currently under analysis.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Cleavage of Stalled Forks by Fission Yeast Mus81/Eme1 in Absence of DNA Replication Checkpoint

During replication arrest, the DNA replication checkpoint plays a crucial role in the stabilization of the replisome at stalled forks, thus preventing the collapse of active forks and the formation of aberrant DNA structures. How this checkpoint acts to preserve the integrity of replication structures at stalled fork is poorly understood. In Schizosaccharomyces pombe, the DNA replication checkpoint kinase Cds1 negatively regulates the structure-specific endonuclease Mus81/Eme1 to preserve genomic integrity when replication is perturbed. Here, we report that, in response to hydroxyurea (HU) treatment, the replication checkpoint prevents S-phase–specific DNA breakage resulting from Mus81 nuclease activity. However, loss of Mus81 regulation by Cds1 is not sufficient to produce HU-induced DNA breaks. Our results suggest that unscheduled cleavage of stalled forks by Mus81 is permitted when the replisome is not stabilized by the replication checkpoint. We also show that HU-induced DNA breaks are partially dependent on the Rqh1 helicase, the fission yeast homologue of BLM, but are independent of its helicase activity. This suggests that efficient cleavage of stalled forks by Mus81 requires Rqh1. Finally, we identified an interplay between Mus81 activity at stalled forks and the Chk1-dependent DNA damage checkpoint during S-phase when replication forks have collapsed