Identifizierung von Mikrodomän-Proteinen und funktionelle Charakterisierung von Cholesterin im Golgi-Apparat

Mittels Detergenzextraktion von Golgimembranen bei 0°C mit anschließender Dichtegradientenzentrifugation wurden sphingolipid- und cholesterinreiche Mikrodomänen isoliert, die zehn Proteine entsprechend der Coomassiefärbung in der SDS-PAGE enthalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die zwei bisher nicht charakterisierten Proteine mit Molekulargewichten von 72 und 56 kDa als Untereinheiten A und B der vakuolären ATPase identifiziert. Daneben konnte mit NAP-22 eine elfte Komponente identifiziert werden, die nur in der Silberfärbung als prominentes Protein erscheint. Bei Hemmung der v-ATPase mit Bafilomycin A1 wird der Transport von Proteinen vor dem Erreichen des TGN inhibiert. Der Protein Transport zwischen intrazellulären Kompartimenten wird durch eine Proteinmaschinerie gesteuert. Während die beteiligten Proteine eingehend untersucht wurden, ist wenig über den Einfluss von Lipiden bekannt. Durch Verwendung eines zellfreien Intra-Golgi-Transportassays konnte gezeigt werden, dass Cholesterin hier eine entscheidende Rolle spielt. Kleine Veränderungen des Cholesteringehalts (+/-10) führen zu einer spezifischen Inhibition des Intra-Golgi-Transports (70 Inhibition). Dies gilt sowohl für die Addition als auch die Depletion. Die Cholesterinextraktion führt zu einer Inhibition der Fusionsreaktion, wie die Verwendung von BFA im Intra-Golgi-Transportassay zeigt. Cholesterin findet sich sowohl in der liquid disordered als auch in der liquid ordered phase. Die Extraktion von Cholesterin erfolgt aus beiden Phasen in gleichem Maße. Im Unterschied dazu wird bei der Zugabe das Cholesterin bevorzugt in die liquid ordered phase eingebaut. Die geringfügigen Veränderungen des Cholesteringehalts führen zur Änderungen des Solubilisierungsverhaltens ausgewählter Golgi Proteine, nämlich der heterotrimeren G-Proteine. Wird Cholesterin mittels MethylbetaCD-Cholesterin-Komplexen zu intakten CHO-Zellen gegeben, so wurde eine Vesikulierung der Golgi-Struktur beobachtet