Identification of DNA-Damage DNA-Binding Protein 1 as a Conditional Essential Factor for Cytomegalovirus Replication in Interferon-γ-Stimulated Cells

The mouse cytomegaloviral (MCMV) protein pM27 represents an indispensable factor for viral fitness in vivo selectively, antagonizing signal transducer and activator of transcription 2 (STAT2)-mediated interferon signal transduction. We wished to explore by which molecular mechanism pM27 accomplishes this effect. We demonstrate that pM27 is essential and sufficient to curtail the protein half-life of STAT2 molecules. Pharmacologic inhibition of the proteasome restored STAT2 amounts, leading to poly-ubiquitin-conjugated STAT2 forms. PM27 was found in complexes with an essential host ubiquitin ligase complex adaptor protein, DNA-damage DNA-binding protein (DDB) 1. Truncation mutants of pM27 showed a strict correlation between DDB1 interaction and their ability to degrade STAT2. SiRNA-mediated knock-down of DDB1 restored STAT2 in the presence of pM27 and strongly impaired viral replication in interferon conditioned cells, thus phenocopying the growth attenuation of M27-deficient virus. In a constructive process, pM27 recruits DDB1 to exploit ubiquitin ligase complexes catalyzing the obstruction of the STAT2-dependent antiviral state of cells to permit viral replication

Use of the cell permeable motif derived from surface antigens of Hepatitis B-virus for antigen transfer and induction of CD8+ T-cell mediated immune responses

Professionell antigenpräsentierende Zellen, z.B. dendritische Zellen, sind für die Induktion einer spezifischen zellulären Immunantwort verantwortlich. Obwohl antigenpräsentierende Zellen sehr effizient Antigene aufnehmen können, gestaltet sich insbesondere die gezielte Einschleusung von Antigenen für die Präsentation über den MHC-Klasse I-Weg schwierig, welche zur Induktion einer CD8+ T-Zellantwort, z.B. gegen Tumorzellen, erwünscht ist. Zellpermeable Moleküle stellen für einen Antigentransfer attraktive Kandidaten dar; sie können die an sie fusionierten bzw. assoziierten Antigene direkt in das Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen eintransportieren und somit dem MHC-I-abhängigen Präsentationsweg zugänglich machen. Eine in der PreS2-Domäne der viralen Oberflächenproteine des humanen Hepatitis B-Virus charakterisierte 12 AS lange Sequenz (TLM) weist die Eigenschaft der Zellpermeabilität auf. Das TLM gelangt in einem energie-, rezeptor- und temperaturunabhängigen Diffusionsprozess in das Zytoplasma von Zellen, ohne die Zellintegrität zu beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential des TLM als Vehikel für einen Antigentransfer untersucht. Verschiedene mit dem TLM modifizierte Antigenspezies (spezifisches CD8+ T-Zellepitop, virale HBV Corepartikel als Epitopträger und gesamte Proteine) wurden auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert, in das Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen zu transduzieren und nach der Internalisierung eine spezifische CD8+ T-Zellantwort zu induzieren. Das Modellprotein Ovalbumin wurde als Schwerpunkt im Rahmen der Arbeit eingesetzt. In der Sequenz von Ovalbumin wurde ein 8 AS langes, H-2Kb restringiertes, immundominantes MHC-Klasse I-Epitop (SIINFEKL) charakterisiert, welches für Untersuchungen des MHC-I-abhängigen Präsentationsweges vorteilhaft ist. Die OT-1 Maus stellt ein transgenes Mausmodell für den passenden spezifischen T-Zell-Rezeptor dar, welcher den SIINFEKL-H-2Kb-Komplex erkennt, und ist damit für funktionelle Studien einsetzbar. Rekombinante Ovalbumin-Proteine, das Wildtyp-Protein (OVA-HA) sowie das am N-Terminus um das TLM verlängerte Protein (TLM-OVA-HA), wurden aus einem bakteriellen Expressionssystem gewonnen. Für TLM-OVA-HA konnte im Gegensatz zu OVA-HA Zellpermeabilität mittels Immunfluoreszenzfärbung beobachtet werden. Die Inkubation von OT-1 Milzzellen mit TLM-OVA-HA führte in vitro zu einer besseren Stimulation von transgenen spezifischen CD8+ T-Zellen als die Inkubation mit OVA-HA. Die Zellen zeigten eine stärkere Expression des Aktivierungsmarkers CD69, eine stärkere Produktion von IFNgamma und eine bessere Proliferation. In einem adoptiven Transfermodell wiesen die transferierten CD8+ T-Zellen in vivo nach Immunisierung mit einer geringen Dosis an TLM-OVA-HA im Vergleich zu OVA-HA eine stärkere Proliferation auf. Weiter konnte eine stärkere zytotoxische Aktivität der spezifischen CD8+ T-Zellen nach Gabe von TLM-OVA-HA im Vergleich zu OVA-HA beobachtet werden. In einem Tumormodell führte die Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit den rekombinanten Ovalbumin-Proteinen nur zu einer schwachen Antitumor-Antwort. Die Insertion des TLM bewirkte ein leicht vermindertes Auswachsen von Tumoren. In OT-1 Mäusen entwickelten alle Tiere nach Immunisierung mit OVA-HA einen Tumor; im Gegensatz dazu blieben nach Immunisierung mit TLM-OVA-HA fast die Hälfte der Tiere tumorfrei. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen das Potential von TLM-Fusionsproteinen auf, einen Antigentransfer in antigenpräsentierende Zellen zu vermitteln und sowohl in vitro als auch in vivo eine CD8+ T-Zellantwort auszulösen.Antigen presenting cells (APCs), e.g. dendritic cells, are responsible for the induction of specific cellular immune responses. Although APCs can take up antigens very efficiently, the insertion of antigens in the MHC class I presentation pathway is often difficult leading to stimulation of CD8+ T-cell mediated immune responses, e.g. against tumour cells. Cell permeable molecules are very attractive tools for mediating antigen transfer. They can translocate antigens (proteins, peptides) fused to them directly into the cytosol of APCs and deliver them into the MHC-class I presentation pathway. Recently a 12 aa long cell permeable peptide in the PreS2-domain of Hepatitis B-virus surface antigens was characterised. This motif (called translocation motif, TLM) can act as a shuttle into the cytosol of cells for peptides and proteins fused to the TLM. The cell permeability is mediated in an energy, receptor and cell type independent way without affecting the cell integrity. In this project the efficient transfer of antigens (specific CD8+ T-cell epitopes, HBV derived core particles as epitope carriers, full length proteins) into the cytosol of APCs via the TLM was investigated. The induction of CD8+ T-cell mediated immune responses against these internalised antigens was characterised. As main part of the project Ovalbumin was used as model antigen. An immunodominant MHC class I binding peptide (SIINFEKL) that elicits H-2Kb restricted cytotoxic T- cells (CTLs) has been identified. The OT-1 mouse is a transgenic mouse model carrying the appropriate T-cell receptor for the H-2Kb-MHC I-SIINFEKL-complex and it is suitable for functional studies. Recombinant Ovalbumin proteins, the wild type protein (OVA-HA) and Ovalbumin which carries the TLM at the N-terminus (TLM-OVA-HA), were produced and purified in a bacterial expression system. The cell permeability of TLM-OVA-HA in contrast to OVA-HA was detected via immunofluorescence staining. Splenocytes of OT-mice were incubated in vitro with recombinant Ovalbumin proteins. In comparison to cultures pulsed with OVA-HA the stimulation kinetics of cells pulsed with TLM-OVA-HA were earlier and higher. Also a stronger secretion of IFNgamma and a better proliferation by the specific CD8+ T-cells were observed. In an adoptive transfer model better proliferation of transferred transgenic CD8+ T-cells was observed in mice immunised with TLM-OVA-HA compared to mice immunised with OVA-HA using small amount of protein. After immunisation with TLM-OVA-HA compared with OVA-HA better cytolytic activity of specific CD8+ T-cells was detected in an in vivo cytotoxic assay. Using a tumour model in C57BL/6 mice only a weak antitumour response was observed after immunisation with recombinant Ovalbumin proteins. Immunisation with TLM-OVA-HA mediated a little better effect compared to immunisation with OVA-HA. Treating OT-1 mice all animals showed tumour growth after immunisation with OVA-HA. In contrast after immunisation with TLM-OVA-HA nearly half of the animals did not develop a tumour. Results of the project show that proteins fused to the TLM can translocate into the cytosol of antigen presenting cells and can induce CD8+ T-cell mediated immune response in vitro and in vivo