ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΕ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥΣ ΕΝΩΣΕΩΝ ΜΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκαν, αξιολογήθηκαν και επικυρώθηκαν νέες διαχωριστικές τεχνικές ανάλυσης για τον ποσοτικό προσδιορισμό ενώσεων με φαρμακευτική δράση. Στο κεφάλαιο 1, περιγράφονται τα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά των αναλυτών. Στην 1η υποενότητα περιγράφονται οι βενζοδιαζεπίνες και δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στην αλπραζολάμη την οποία προσδιορίσαμε σε ανθρώπινο πλάσμα. Γίνεται αναφορά στο μηχανισμό φαρμακολογικής, τη φαρμακοκινητική και τις θεραπευτικές ενδείξεις της αλπραζολάμης. Η 2η υποενότητα του κεφαλαίου είναι αφιερωμένη στην υπέρταση με έμφαση στην αλισκιρένη και το υδροχλωροθειαζίδιο στα οποία μελετήθηκε η χημική κινητική σε συνθήκες επιταχυνόμενης αποικοδόμησης. Περιγράφονται η θεραπευτική αντιμετώπιση της υπέρτασης, ο μηχανισμός δράσης και τα φαρμακικινητικά χαρακτηριστικά των αναλυτών. Στη 3η υποενότητα του ίδιου κεφαλαίου γίνεται αναφορά σε θέματα φυσιολογίας του δέρματος και περιγράφεται ο μηχανισμός δράσης των αντιιδρωτικών και των αποσμητικών προϊόντων. Γίνεται αναφορά στο ρόλο του αργιλίου σε αντιιδρωτικά προϊόντα και περιγράφονται δημοσιευμένες μελέτες για την πιθανή τοξικότητα του. Στο κεφάλαιο 2, αναφέρονται οι αρχές λειτουργίας της υγροχρωματογραφίας - φασματομετρίας μαζών. Αναφέρονται οι πηγές ιοντισμού σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην τεχνική ιοντισμού μέσω ηλεκτροψεκασμού όπου περιγράφονται οι παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία της τεχνικής ESI. Γίνεται αναφορά στους πλέον συνηθσμένους αναλυτές μαζών με έμφαση στον γραμμικό τετραπολικό αναλυτή όπου περιγράφεται η γενική αρχή λειτουργίας του, ενώ τέλος περιγράφεται η αρχή λειτουργίας του ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή που είναι ο συνηθέστερα χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής ιόντων. Στο κεφάλαιο 3, γίνεται αναφορά στο μηχανισμό συγκράτησης στη χρωματογραφία HILIC, στις στατικές φάσεις και την επιλογή των κατάλληλων χρωματογραφικών συνθηκών, ενώ στο τελευταίο μέρος αναφέρονται χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογών της στη φαρμακευτική ανάλυση. Στο κεφάλαιο 4, περιγράφονται οι γενικές αρχές της πορείας ανάπτυξης μεθόδου για μελέτες σταθερότητας και οι αρχές για την κινητική μελέτη χημικών αντιδράσεων. Περιγράφεται ο τρόπος υπολογισμού των κυριώτερων κινητικών παραμέτρων Στο κεφάλαιο 5, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος HILIC-ESI/MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό της αλπραζολάμης και του βασικού μεταβολίτη της, α-υδροξυ αλπραζολάμη, σε ανθρώπινο πλάσμα η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε κλινικές μελέτες με στόχο την παρακολούθηση των επιπέδων των φαρμάκων αυτών σε ασθενείς και ρύθμιση της δοσολογίας τους. Για χρωματογραφία HILIC χρησιμοποιήθηκε στήλη XBridge-HILIC 135 Å, μεγέθους σωματιδίων 3,5 μm. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα LC-ESI/MS με αναλυτή απλό τετράπολο και εφαρμόστηκε η τεχνική ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό για την ανίχνευση των αναλυτών. Διαπιστώθηκε ικανοποιητική γραμμικότητα για την αλπραζολάμη σε εύρος συγκεντρώσεων 2,5-250 ng mL-1 και 2,5-50 ng mL-1 για την α-υδροξυ αλπραζολάμη. Οι % σχετικές αποκλίσεις εντός της ημέρας (% RSDintra-day) κυμαίνονται μεταξύ των τιμών 2,4 και 6,8% για την αλπραζολάμη και 4,5 έως 5,3% για την α-υδροξυ αλπραζολάμη και οι % σχετικές αποκλίσεις μεταξύ των ημερών (%RSDinter-day) για την αλπραζολάμη βρέθηκε ότι δεν ήταν μεγαλύτερη από 1,9% και για τον μεταβολίτη της κυμάνθηκε μεταξύ 1 και 3%. H ολική ακρίβεια εκφράζεται από το επί τις εκατό σχετικό σφάλμα, Er %, το οποίο για την αλπραζολάμη κυμάνθηκε από -3,1 έως 4,1 και για την α-υδροξυ αλπραζολάμη από 0,1 έως 2,2. Βρέθηκε ότι η μέθοδος είναι ειδική και εκλεκτική, χωρίς να παρεμποδίζεται από τα συστατικά του πλάσματος. Ο χρόνος κάθε ένεσης δεν ξεπερνούσε τα 10 λεπτά. Στο κεφάλαιο 6, έγιναν μελέτες αποικοδόμησης της αλισκιρένης και του υδροχλωροθειαζιδίου σε συνθήκες επιταχυνόμενης αποικοδόμησης. Από τα πειραματικά αποτελέσματα της παρούσας μελέτης της χημικής υδρόλυσης της αλισκιρένης και του υδροχλωροθειαζειδίου προκύπτει ότι και οι δύο αναλύτες ακολουθούν ψευδοταξική κινητική πρώτης τάξης. Η αποικοδόμηση της αλισκιρένης σε όξινο περιβάλλον οδηγεί σε δύο προϊόντα διάσπασης που εκλούονται στα 2,22 και 14,55 λεπτά, σε αλκαλικές συνθήκες προκύπτει ένα προϊόν διάσπασης που εκλούεται στα 2,99 λεπτά, ενώ σε οξειδωτικές συνθήκες προκύπτουν δύο νέα προϊόντα διάσπασης που εκλούονται στα 3,13 και 7,89 λεπτά. Από τις μελέτες αποικοδόμησης του υδροχλωροθειαζιδίου δεν προέκυψε κάποιο προϊόν αποικοδόμησης που να ανιχνεύεται στο μήκος κύματος που χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Τέλος, στο Κεφάλαιο 7, περιγράφεται η ανάπτυξη και αξιολόγηση μιας εκλεκτικής μεθόδου ανάλυσης για τον προσδιορισμό του υδροξυχλωριούχου αργιλίου σε αντιιδρωτική κρέμα. Η χρωματογραφική ανάλυση έγινε με τη χρήση συστήματος RP-HPLC με ανιχνευτή UV-Vis, σε χρωματογραφική στήλη XTerra MS C18 με διάμετρο πόρων 5 μm, (150 x 3 mm i.d.) και κινητή φάση ακετονιτρίλιο/H2O, 15:85 (v/v) που περιείχε 0,08% τριφθοροξικό οξύ και ταχύτητα ροής 0,3 mL min-1. Η μέθοδος επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας εμβολιασμένα δείγματα αντιιδρωτικής κρέμας. Η κατασκευή των καμπυλών βαθμονόμησης πραγματοποιήθηκε με σειρά μετρήσεων σε γραμμική περιοχή συγκεντρώσεων από 3,7 μέχρι 30,6 μg mL-1. Το όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης βρέθηκε ότι είναι 1,24 και 3,7 μg mL-1, αντίστοιχα. Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από γραμμικότητα, ικανοποιητική ορθότητα και πιστότητα, τόσο εντός της ημέρας, όσο και μεταξύ των ημερών. Η εντός της ημέρας, % σχετική τυπική απόκλιση (intra day % RSD) βρέθηκε μικρότερη από 3,7 %, και η μεταξύ των ημερών, % σχετική τυπική απόκλιση (inter day % RSD) μικρότερη από 5,5%, το ποσοστό του σχετικού τυπικού σφάλματος (Er %) βρέθηκε από -3,8 έως 1,5. Η μέθοδος κρίθηκε ανθεκτική καθώς μικρές και σταδιακές μεταβολές κάποιων παραμέτρων επέφεραν ελάχιστες μόνο διακυμάνσεις στις υπόλοιπες παραμέτρους. Η αναπτυχθείσα μεθοδολογία εφαρμόστηκε με επιτυχία σε αναλύσεις κοσμητολογικού αντιιδρωτικού σκευάσματος που παρασκευάσθηκε στο ΤΕΙ Αθήνας. Τα παραπάνω αποτελέσματα σε συνδυασμό με το μικρό χρόνο ανάλυσης (~6 λεπτά) καθιστούν τη μέθοδο κατάλληλη να εφαρμοστεί σε αναλύσεις ρουτίνας.In this work novel analytical separation techniques have been developed and validated for the quantitative determination of pharmaceutical compounds. Chapter 1, describes the pharmacological characteristics of substances used for anxiety disorders such as benzodiazepines, and in particular the mechanism of action and therapeutic effects of alprazolam. The second subsection of this chapter describes the treatment of hypertension, the mechanism of action and the pharmacokinetic characteristics of aliskiren and hydrochlorothiazide. In the third subsection of the same chapter the mechanism of action of antiperspirant and deodorant products. Chapter 2, describes the operating principles of liquid chromatography - mass spectrometry which is a frequently used hyphenated analytical technique in the field of pharmaceutical analysis. A thorough description of the instrumentation including atmospheric pressure ionization sources, mass analyzers and mass detectors is also included in this chapter. In chapter 3, an overview of the HILIC separation system comparing it to other chromatographic modes is described. Furthermore, the progress in understanding the separation mechanism along the new trends in HILIC packing materials is discussed. Characteristic applications of HILIC mode chromatography in the field of pharmaceutical analysis are also presented. Chapter 4, refers to the general principles for the development of an stability-indicated HPLC method. The second part of this chapter is dedicated to a basic introduction to the chemical kinetics of simple reaction systems in solution. In Chapter 5, a hydrophilic interaction liquid chromatography /positive ion electrospray-mass spectrometry (HILIC-ESI/MS) method has been developed and fully validated for the quantification of alprazolam and its main metabolite, a-hydroxy-alprazolam, in human plasma. The assay is based on 50 μL plasma samples, following liquid-liquid extraction. All analytes and the internal standard (tiamulin) were separated by hydrophilic interaction liquid chromatography using an X-Bridge-HILIC analytical column (150 x 2.1 mm i.d., particle size 3.5μm) under isoscratic elution. The mobile phase was composed of a 7% 10 mM ammonium formate water solution in acetonitrile and pumped at a flow rate of 0.20 mL min-1. Running in positive electrospray ionization and selected ion monitoring (SIM) the mass spectrometer was set to analyze the protonated molecules [M+H]+ at m/z 309, 325 and 494 for alprazolam, a-hydroxy-alprazolam and tiamulin (internal standard) respectively. The assay was linear over the concentration range of 2.5-250 ng mL-1 for alprazolam and 2.5-50 ng mL-1 for a-hydroxy alprazolam. The method is the first reported application of HILIC in the analysis benzodiazepines in human plasma. With a small sample size (50 μL human plasma) and a run time less than 10 min for each sample the method can be used to support a wide range of clinical studies concerning alprazolam quantification. In Chapter 6, chemical kinetics of aliskiren and hydrochlorothiazide have been investigated under acidic, basic and oxidative comditions. The rate constants (k) along with half-life’s, t½, obtained from the acidic, basic and oxidative stressed samples of aliskiren and hydrochlorothiazide have been determined. For this purpose a reversed-phase HPLC method on a silica-based phenyl analytical column have been partially validated and quantification of the analytes was based on peak area values. It was found that both compounds follow pseudo-first order reaction kinetics. The degradation of aliskiren under basic conditions proceeded slowly with one unknown degradation peak at 2.99 min. In the acid stressed samples, two unknown degradation peaks appeared at retention times 2.22 min and 14.45 min. Under oxidative conditions, two unknown degradation products appeared at 3.13 and 7.89 min along with a strong interaction peak at 0.82 min that is due to the presence sodium peroxide in the sample. Degradation of hydrochlorothiazide did not reveal any degradation product that could be detected at the wavelength used for this assay. Chapter 7 describes the development and validation of a selective high-performance liquid chromatography method that allows, after liquid-liquid extraction and pre-column derivatization reaction with quercetin, the quantification of aluminium chlorohydrate in antiperspirant creams. Chromatographic separation was achieved on an XTerra MS C18 analytical column (150mm x 3,0 mm i.d., particle size 5 μm) using a mobile phase of acetonitrile: water (15:85, v/v) containing 0.08% trifluoroacetic acid at a flow rate of 0.30 mL min-1. Ultraviolet (UV) spectrophotometric detection at 415nm was used. The assay was linear over a concentration range of 3.7-30.6 μg mL-1 for aluminium. The method was used to quantify aluminium in antiperspirant creams containing 11 %, 13 % and 16 % (w/w) aluminium chlorohydrate, respectively.

Quantitation of Acetyl Hexapeptide-8 in Cosmetics by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Coupled to Photo Diode Array Detection

Bioactive peptides are gaining more and more popularity in the research and development of cosmetic products with anti-aging effect. Acetyl hexapeptide-8 is a hydrophilic peptide incorporated in cosmetics to reduce the under-eye wrinkles and the forehead furrows. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) is the separation technique of choice for analyzing peptides. In this work, a rapid HILIC method coupled to photodiode array detection operated at 214 nm was developed, validated and used to determine acetyl-hexapeptide-8 in cosmetics. Chromatography was performed on a Xbridge® HILIC BEH analytical column using as mobile phase a 40 mM ammonium formate water solution (pH 6.5)-acetonitrile mixture 30:70, v/v at flow rate 0.25 mL min−1. The assay was linear over the concentration range 20 to 30 μg mL−1 for the cosmetic formulations and 0.004 to 0.007% (w/w) for the cosmetic cream. The limits of quantitation for acetyl hexapeptide-8 were 1.5 μg mL−1 and 0.002% (w/w) for the assay of cosmetic formulations and cosmetic creams, respectively. The method was applied to the analysis of cosmetic formulations and anti-wrinkle cosmetic creams