Study of the Shigella flexneri type 3 secretion system activation and escape from autophagy

Shigella est une bactérie pathogène à Gram-négatif qui cause la shigellose ou dysenterie bacillaire. Cette maladie est une cause importante de morbidité chez les jeunes enfants et les adultes dans les pays en développement, avec presqu’un million de morts par an. Jusqu'à ce jour, aucun vaccin efficace contre Shigella n’est disponible et la prévalence croissante de souches multirésistantes fait de Shigella une menace importante en termes de santé publique. La virulence de Shigella est médiée par la sécrétion d'un arsenal de protéines (effecteurs) capables d'interférer avec diverses voies de signalisations de la cellule hôte. La sécrétion de effecteurs dépend d'un système de sécrétion de type 3 (SST3), véritable aiguille moléculaire assemblée à la surface bactérienne permettant l’injection les protéines de virulence dans le cytoplasme de la cellule hôte. Le SST3 est assemblé à 37 °C et est composé de trois parties distinctes: i) un bulbe cytoplasmique, ii) un corps basal et ii) une aiguille extracellulaire. Cette dernière est constituée de l’assemblage d’une centaine de copies de la protéine MxiH pour la partie extracellulaire et de plusieurs copies de la protéine MxiI pour la partie périplasmique. Avant le contact cellulaire, le SST3 est maintenu dans un état "OFF" d’une part, par un complexe de protéines (IpaD et IpaB) localisé au sommet de l’aiguille et, d’autre part par une protéine (MxiC) probablement située à la base du SST3 via son interaction avec MxiI. Suite au contact cellulaire, le SST3 est activé et permet la sécrétion d’IpaC, protéine hydrophobe formant, avec IpaB, un pore dans la membrane de la cellule hôte pour permettre la translocation des effecteurs. Suite à la détection du contact cellulaire par le complexe d’extrémité (IpaB et IpaD), un signal est transmit jusqu’à la base de l’aiguille afin d’activer la sécrétion de MxiC et finalement celle des effecteurs. Des études mutationnelles ont montré que la transmission du signal d'activation du haut vers la base de l’aiguille implique les sous-unités de l’aiguille MxiH et MxiI. Ce signal permet la dissociation de MxiC et MxiI et donc la libération des effecteurs. Dans ce travail, nous avons caractérisé le rôle de MxiI dans la transmission du signal d'activation de la sécrétion via une série de mutations dirigées et aléatoires et déterminé le domaine responsable de son interaction avec MxiC. D'autre part, nous avons mis en évidence un lien entre la sécrétion de MxiC par le SST3 et celle d'un effecteur, IcsB. IcsB nécessite une protéine chaperon, IpgA, pour sa stabilité et sa sécrétion. Une fois sécrétée, elle joue différentes fonctions dans la cellule hôte et notamment, permet l’échappement de Shigella à l’autophagie. Dans ce travail, nous avons montré que IcsB est capable de lier le cholestérol et que cette liaison est nécessaire pour l’échappement de de la bactérie à l’autophagie. Nous avons montré, en utilisant des approches biochimiques, qu’IcsB pourrait avoir une activité de type cystéine protéase via une diade catalytique conservée (C306 et H145). Nous avons identifié de nouveaux partenaires d'interaction d’IcsB, tels que OspB et VirA, ce qui pourrait permettre de mieux comprendre la fonction d’IcsB dans la cellule. En conclusion, ce travail a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation du SS T3 ainsi que la fonction de l'effecteur IcsB dans la virulence de Shigella.Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)info:eu-repo/semantics/nonPublishe

Escape of intracellular Shigella from autophagy requires binding to cholesterol through the type III effector, IcsB.

Type III secretion systems are present in many pathogenic bacteria and mediate the translocation of bacterial effectors into host cells. Identification of host targets of these effectors is crucial for understanding bacterial virulence. IcsB, a type III secretion effector, helps Shigella to evade the host autophagy defense system by binding to the autophagy protein, Atg5. Here, we show that IcsB is able to interact specifically with cholesterol. The cholesterol binding domain (CBD) of IcsB is located between residues 288 and 351. Specific mutations of single tyrosine residues Y297 or Y340 of IcsB by phenylalanine (F) slightly reduced cholesterol binding, whereas deletion of the entire CBD or double mutation Y297F-Y340F strongly abolished interactions with cholesterol. To determine whether Shigella expressing IcsB variants could evade autophagy as effectively as the wild-type Shigella, we infected MDAMC cells stably expressing the autophagy marker LC3 fused to GFP and bacterial autophagosome formation was quantified using fluorescence microscopy. Mutation Y297F or Y340F slightly impaired IcsB function, whereas complete removal of CBD or mutation Y297F-Y340F significantly impaired autophagy evasion. Furthermore, we report that BopA, the counterpart of IcsB in Burkholderia pseudomallei with similar autophagy-evading properties, contains the CBD domain and is also able to bind cholesterol.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

The inner-rod component of Shigella flexneri type 3 secretion system, MxiI, is involved in the transmission of the secretion activation signal by its interaction with MxiC.

The virulence of Shigella mainly resides in the use of a Type 3 Secretion System (T3SS) to inject several proteins inside the host cell. Three categories of proteins are hierarchically secreted: (1) the needle components (MxiH and MxiI), (2) the translocator proteins which form a pore (translocon) inside the host cell membrane, and (3) the effectors interfering with the host cell signaling pathways. In the absence of host cell contact, the T3SS is maintained in an “off” state by the presence of a tip complex. We have previously identified a gatekeeper protein, MxiC, which sequesters effectors inside the bacteria probably by interacting with MxiI, the inner-rod component. Upon cell contact and translocon insertion, a signal is most likely transmitted from the top of the needle to the base, passing through the needle and allowing effectors release. However, the molecular mechanism underlying the transmission of the activation signal through the needle is still poorly understood. In this work, we investigate the role of MxiI in the activation of the T3SS by performing a mutational study. Interestingly we have shown that mutations of a single residue in MxiI (T82) induce an mxiC-like phenotype and prevent the interaction with MxiC. Moreover, we have shown that the L26A mutation significantly reduces T3 secretion. The L26A mutation impairs the interaction between MxiI and Spa40, a keystone component of the switch between needle assembly and translocators secretion. The L26A mutation also sequesters MxiC. All these results highlight the crucial role of MxiI in regulating the secretion and transmitting the activation signal of the T3SS.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe