Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL

Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1. Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist

Depletion des Myc-interagierenden Zinkfingerproteins 1 mittels RNA Interferenz und Die Rolle von Miz-1 in der zellulären DNA Schadensantwort auf UV-Licht

Die vorliegende Dissertationsarbeit beschäftigte sich zum einen methodisch mit dem Gen-Knock-out des mit Myc interagierenden Proteins Miz-1 mittels der kürzlich erschlossenen Technik der RNA Interferenz in Säugerzellen. Zum anderen wurde unter Nutzung der RNA Interferenz ein Zusammenhang aus dem Bereich zellulärer Schadenskontrollmechanismen, speziell der Regulation der UV-induzierten DNA-Schadensantwort durch das Myc interagierende Protein Miz-1 geklärt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Nutzung eines evolutionär konservierten Abwehrmechanismus der Zelle gegen Fremdgene, der RNA Interferenz. Der Knock-out mittels RNA Interferenz ersetzt zunehmend die konventionellen Gen-Knock-out-Technologien. Durch RNA Interferenz Versuche mit Kotransfektion eines Glühwürmchen-Luziferase-kodierenden Plasmids und eines sequenz-homologen RNA-Doppelstrangs konnte ein deutlicher Rückgang der Plasmid-induzierten Lumineszenz gegenüber den allein mit Reporter-Plasmid transfizierten oder mit Nonsense-RNA kotransfizierten Zellen erreicht werden. Mittels dieses spezifischen Knock-out eines Gens wurde die Eignung der Säugerzelllinien HaCaT, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie, HeLa, ebenfalls humaner Zervix-Karzinom-Zellen und MEF, primärer muriner Embryo-Fibroblasten zur RNA Interferenz dargelegt. Anschließend wurde die Depletion des Transkriptionsfaktors Miz-1 durchgeführt. Ähnlich wie in zahlreichen bisherigen RNA Interferenz-Versuchen in Säugerzellen konnte nur ein partieller Knock-out des Gens erreicht werden. Aber auch eine partielle Depletion eines Gens hat Auswirkungen auf den resultierenden Phänotyp. Die Möglichkeit eines partiellen Miz-1 Knock-out, auch als Knock-down bezeichnet, eröffnet umfangreiche Möglichkeiten der Funktionsanalyse des Gens und seiner Interaktionspartner sowie der Analyse Miz-1-abhängiger Signaltransduktionswege. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden. Dabei wurde ein vom Tumorsuppressor p53 abhängiger sowie ein p53-unabhängiger Schadens-Kontrollpunkt untersucht und die jeweilige Bedeutung des Transkriptionsfaktors Miz-1 geprüft. Zur Analyse der p53-abhängigen zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden wurden ARF / Maus-Embryo-Fibroblasten verwandt, da Myc in UV bestrahlten Wildtyp-MEF-Zellen eigenständig über ARF Apoptose induziert. Durch p53 werden eine Reihe von Genen, unter anderem der CdK-Inhibitor p21cip1, aktiviert, die Zellzyklusarrest oder Apoptose einleiten. Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, ist für die p21cip1-Expression in der UV-Antwort neben dem Tumorsuppressor p53 die Anwesenheit des Transkriptionsfaktors Miz-1 notwendig. Nach Depletion des Myc interagierenden Proteins mittels RNA Interferenz liegt eine gehemmte Expression des CdK-Inhibitors p21cip1 vor. Mit der Depletion von Miz-1 durch RNA Interferenz vergleichbar ist der funktionelle Ausfall der Aktivität von Miz-1 in Zellen mit deregulierter Expression von Myc. In MEF-Zellen verhindert eine Überexpression des Onkogens die UV-induzierte Aktivierung der Expression von p21cip1. Folge ist die verkürzte Dauer des Zellzyklusarrestes und ein rascher Wiedereintritt der geschädigten Zelle in den Zellzyklus. Anzunehmen ist also, dass die negative Regulation der DNA-Schadensantwort auf UV-Licht durch Myc in Miz-1 abhängiger Weise erfolgt. Anhand eines Zellsystems p53-defizienter humaner Keratinozyten konnte die p53-unabhängige Schadensantwort auf verschiedene DNA-schädigende Agenzien untersucht werden. Ein für HaCaT-Zellen ermittelter Signaltransduktionsweg nach DNA-Schädigung wurde zunächst reproduziert. Die UV-Bestrahlung der Keratinozyten löst eine transiente Repression des Topoisomerase-bindenden Proteins TopBP1 aus. Das aus dem inhibitorischen Komplex mit TopBP1 frei werdende Miz-1 veranlasst die transkriptionelle Aktivierung des CdK-Inhibitors p15INK4B. Ähnlich der Induktion der p21cip1-Expression ist das Resultat des UV-Schadens die Aktivierung eines CdK-Inhibitors mit folgendem Zellzyklusarrest. Die Zytostatika Zeozin und Hydroxy-Harnstoff zeigten keinen Einfluss auf die Expression von Myc, Miz, TopBP1 oder p15INK4B, den beteiligten Interaktionspartnern des Schadens-Kontrollpunktes der UV-Antwort der Keratinozyten-Zelle. Die Ergebnisse sprechen für die Schadens-Spezifität der p53-unabhängigen UV-Antwort. Der untersuchte Signaltransduktionsweg ist an der zellulären Antwort auf die Zytostatika-induzierten DNA-Defekte nicht beteiligt. Es ist möglich, dass der Miz 1/TopBP1-Komplex Bestandteil eines ausschließlich durch UV-Licht ausgelösten Schadens-Kontrollpunktes ist

Regulation der Genexpression von MYCN in humanen Neuoblastomzellen durch Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie

Seit fast 30 Jahren ist bekannt, dass die Amplifikation und Expression des Onkogens MYCN in Neuroblastomen mit einer sehr ungünstigen Prognose für die Patienten einhergeht. Dennoch liegen die Mechanismen der Genregulation von MYCN weiterhin größtenteils im Dunkeln. Die Präsenz potentieller Bindungsstellen für E2F-Proteine im Promotor des MYCN-Gens sowie Zellkulturexperimente lieferten Hinweise auf eine Rolle der Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie in der Regulation der N-myc-Expression. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob E2F-Proteine notwendig sind, um eine primär hohe Expression von N-myc in Neuroblastomzellen mit Amplifikation des Onkogens aufrechtzuerhalten, und ob sie hinreichend sind, um die Transkription von MYCN in Zellen ohne endogene Expression von N-myc einzuleiten. Durch Überexpression des Tumorsuppressorproteins p16, welches zu einer Inaktivierung endogener E2F-Proteine führt, konnte die MYCN-mRNA-Menge in Neuroblastomzellen deutlich gesenkt werden. Vergleichbare Resultate wurden durch Expression von dominant negativem E2F-1 erzielt. Da in einigen Studien gezeigt werden konnte, dass Myc-Proteine ihrerseits E2F-Gene aktivieren können, nehmen wir an, in aggressiven Neuroblastomen könnte eine positive Rückkopplungsschleife zwischen E2F-Transkriptionsfaktoren auf der einen und N-myc auf der anderen Seite existieren, die die gesteigerte Aktivität des MYCN-Onkogens aufrechterhält. Stabil transfizierte E2F-ER-Fusionsproteine waren jedoch nicht in der Lage, das endogene MYCN-Gen in Neuroblastomzellen ohne Expression von N-myc anzuschalten. E2F-Proteine werden folglich für das volle Ausmaß der starken Expression von N-myc in Neuroblastomen benötigt, sind aber nicht ausreichend, um das Onkogen MYCN in Zellen ohne endogenes N-myc zu aktivieren. In der Zukunft könnte durch Verhinderung der Bindung von E2F-Proteinen an den MYCN-Promotor oder durch gentherapeutische Ansätze, die z.B. mittels viraler Infektion den Signalweg zwischen p16 und E2F rekonstruieren, die Expression von N-myc in Neuroblastomen gesenkt werden, so dass die Aggressivität der Tumore reduziert und die individuelle Prognose der Patienten verbessert werden könnte

Transduktion und Zellzyklusregulation durch das rekombinante Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein in Neuroblastomzellen

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten Tumorerkrankung im Kindesalter. Das Tumorsuppressorprotein, p27(KIP1), ist ein prognostischer Faktor bei Neuroblastomerkrankungen und korreliert positiv mit einer guten Prognose der Erkrankung. Das Tat-Fusionsprotein ist ein erst kürzlich beschriebenes Konstrukt für die Proteintransduktion und stellt eine Alternative zur konventionellen Gentherapie dar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein hergestellt und dieses in die Neuroblastomzellen substituiert und die darausfolgende Konsequenz bezüglich des Zellzyklus untersucht, um so die prognosebestimmende Wirkung des p27(KIP1)-Proteins bei Neuroblastomen besser verstehen zu können

Identifizierung von Kaiso Like 1 (Zbtb4) als negativem Regulator der P21CIP1-Expression, Interaktionspartner von Miz1 und Histondeacetylasen sowie Modulator der zellulären p53-Antwort

Kaiso Like 1 (Zbtb4) ist ein neu identifiziertes Protein, das zur Familie der BTB/POZ-Domänen-Zinkfinger-Proteine zählt. Aufgrund seiner Homologie zu dem Transkriptionsfaktor und POZ-Protein Kaiso wurde es Kaiso Like 1 benannt. Wegen seiner Gruppenzugehörigkeit zu den BTB-Proteinen wird es auch Zbtb4 genannt. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war über Kaiso Like 1 (KL1) einzig bekannt, dass die Expression seiner mRNA in Neuroblastomen, die mit einer schlechten Prognose einhergehen, gegenüber Neuroblastomen mit einer guten Prognose herunterreguliert ist. Eine Oncomine-Datenbankanalyse hat dieses Expressionsmuster für viele weitere solide Tumoren bestätigt. Ebenso hat sie ergeben, dass die mRNA-Expression von KL1 in soliden Tumoren im Vergleich zu Normalgewebe herunterreguliert ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, KL1 näher zu charakterisieren, hierbei Interaktionspartner und Zielgene sowie eine mögliche biologische Funktion zu identifizieren. Zur Charakterisierung wurde KL1 im Zellkultursystem sowohl überexprimiert als auch depletiert. Eine starke Überexpression von KL1 induziert Apoptose in humanen Zelllinien, die durch eine FACS-Analyse nachgewiesen werden konnte. Zellen, die KL1 in geringen Mengen überexprimieren, sowie KL1-depletierte Zellen weisen jedoch unter normalen Zellkulturbedingungen keinen spezifischen Phänotyp im Vergleich zu Kontrollzellen auf. Um eine biologische Funktion von KL1 zu identifizieren, dessen mRNA-Expression in schlecht prognostischen Tumoren herunterreguliert ist, wurde KL1 in der Neuroblastomzelllinie SH-EP depletiert und die Zellen mit verschiedenen in der Neuroblastomtherapie eingesetzten Chemotherapeutika behandelt. KL1-depletierte Zellen überleben die Behandlung mit niedrig dosiertem Vincristin, während die Kontrollzellen absterben. Vincristin induziert keinen DNA-Schaden, sondern hemmt, niedrig dosiert, die Dynamik der Mikrotubuli. Dies führt zu einer Aktivierung von p53, welches daraufhin seine pro-apoptotischen Zielgene sowie P21CIP1 aktivieren kann, über das p53 den G1-Arrest im Zellzyklus vermittelt. In dieser Arbeit wurde die Ursache für die Resistenz KL1-depletierter Zellen herausgefunden: KL1 blockiert spezifisch den p53 induzierten G1-Arrest, indem es als Repressor die Transaktivierung seines neu identifizierten Zielgenes P21CIP1 hemmt. In KL1-depletierten Zellen entfällt diese Repression, so dass sich die p53-Antwort nach Behandlung mit niedrig dosiertem Vincristin von Apoptose in Richtung G1-Arrest mit anschließend niedriger Proliferationsrate verschiebt. Eine gleichzeitige Depletion von P21CIP1 hebt die Resistenz KL1-depletierter Zellen gegenüber Vincristin größtenteils wieder auf. Um zu zeigen, dass KL1 die p53-Antwort generell und nicht nur nach Behandlung mit Vincristin moduliert, wurden SH-EP-Zellen, die KL1 überexprimieren, sowie Kontrollzellen mit Nutlin-3, einem Stabilisator der p53-Aktivität, behandelt. Während die Kontrollzellen unter den gewählten Bedingungen mit einem G1-Arrest (nicht mit Apoptose) auf die Behandlung reagieren, durchlaufen SH-EPZellen, die KL1 überexprimieren, einen normalen Zellzyklus. Die KL1 vermittelte Repression der P21CIP1-Expression erfolgt dabei unabhängig von p53, wahrscheinlich durch Interaktion mit Miz1 und Histondeacetylase-Repressorkomplexen am P21CIP1-Promotor: In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Hemmung der Histondeacetylase-Aktivität zu einer Abnahme der KL1 vermittelten Repression der P21CIP1-Expression führt und KL1 die Miz1 vermittelte Transaktivierung des P21CIP1-Promotors in Reporter-Assays blockiert. Darüber hinaus wurde in Co-Immunopräzipitationsanalysen eine Interaktion zwischen den exogenen Proteinen KL1 und Miz1 unter anderem mit der Histondeacetylase 2 nachgewiesen. Ebenso gelang der Interaktionsnachweis von KL1 und endogenem Miz1. Eine In-vivo-Bindung von KL1 an den P21CIP1-Promotor und eine In-vitro-Bindung von KL1 an KL1-Bindungssequenzen des P21CIP1-Promotors sowie an Miz1-Bindungssequenzen, wenn Miz1 co-exprimiert wurde, konnte ebenso nachgewiesen werden. In dieser Doktorarbeit wurde KL1 über die Hemmung von P21CIP1 als ein weiterer Faktor in Neuroblastomzellen identifiziert, der die p53-Antwort kontrolliert. Andere Studien zeigen, dass p21Cip1 je nach zellulärem Kontext eine Funktion als Tumorsuppressor oder als Onkogen ausüben kann. KL1 als Repressor der P21CIP1-Expression könnte demnach die onkogene Funktion von p21Cip1 in soliden Tumoren hemmen. Darin könnte der Grund für die Herunterregulation der KL1-mRNA-Expression liegen. Als therapeutisches target eignet sich KL1 jedoch nicht generell. Die Herunterregulation seiner Expression führt nur spezifisch zu einer Resistenz gegenüber niedrig dosiertem Vincristin und nicht gegenüber anderen in der Neuroblastomtherapie eingesetzten Chemotherapeutika. Ursache hierfür ist, dass DNA schädigende Chemotherapeutika nicht nur einen p53 vermittelten G1-Arrest induzieren, der durch KL1 über Hemmung der P21CIP1-Expression blockiert werden kann, sondern auch einen G2-Arrest, der unabhängig von p21Cip1 ist

Die p300 Protein Acetyltransferaseaktivität supprimiert eine dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus ähnliche Autoimmunerkrankung in Mäusen

p300, als eine von 15 beschriebenen Acetyltransferasen der Mammalia, besitzt zahlreiche Interaktionspartnern, die gleichzeitig als Substrate der Acetylierung fungieren. Unter diesen sind Proteine, die in der Hämatopoese eine essentielle Rolle spielen. Eine konditionelle Knock-In-Maus mit heterozygoter Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 (p300AS) in der Keimbahn ist embryonal letal, wohingegen heterozygote Knock-Out-Mäuse für p300 und embryonale Stammzellen, die homozygot für die Mutation waren, lebensfähig sind. Des Weiteren sind mehrere Mutationen der p300-Acetyltransferaseaktivität in Leukämien bekannt. Zusammenfassend lassen diese Daten eine Rolle der p300-Acetyltransferaseaktivität in der Hämatopoese der Mäuse vermuten. Daher wurde mit dieser Arbeit die Funktion der p300-Acetyltransferaseaktvität während der B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass Mäuse mit Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 ausschließlich in B-Zellen aufgrund der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung frühzeitig sterben. Diese Erkrankung ist in ihrer Pathologie ähnlich dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus (SLE). Die pathologischen Erscheinungen der Mäuse umfassen eine Splenomegalie, Glomerulonephritis, Vaskulitis, Einlagerungen von Immunglobulinkomplexen in verschiedenen Organen und die Produktion von Autoantikörpern gegen dsDNA und andere nukleäre Antigene. Das frühere Sterben der Weibchen gegenüber den Männchen ist ein weiteres Merkmal des humanen SLE, bei dem über 90% der Patienten Frauen sind. Die fehlende p300-Acetyltransferaseaktivität in den B-Zellen führt neben einer reduzierten Anzahl an transitionellen und Marginalzonen-B-Zellen in der Milz zu einem partiellen Verlust der B-Zell-Differenzierung in den Mäusen. Mäuse mit einer induzierten ubiquitären Expression des mutierten p300 entwickeln ebenfalls eine SLE-ähnliche Autoimmunerkrankung. Daraus lässt sich schließen, dass die p300-Acetyltransferaseaktivität notwendig für die Regulation der Selbsttoleranz der B-Zellen sowie deren Differenzierung ist. Ebenso zeigt dies, dass die Acetyltransferaseaktivität von p300 die Ausbildung einer SLE-ähnlichen Autoimmunerkrankung supprimiert. Neben diesem Phänotyp der B-Zellen konnte ich zeigen, dass die B-Zellen mit Expression des Acetyltransferase-defizienten p300 dennoch in der Lage sind, in vivo Immunglobuline zu bilden, welche insbesondere für die Isotypen IgG2b und IgM erhöht sind. FACS-Analysen zeigen, dass die erhöhten Mengen an Immunglobulinen mit einer höheren Anzahl an aktivierten B-Zellen in der Milz dieser Mäuse korrelieren. Eine Analyse der humoralen Immunantwort gegenüber dem T-Zell-abhängigen Antigen Ovalbumin verdeutlicht eine bereits erhöhte Anzahl an Ovalbumin-spezifischen Antikörpern vor der Immunisierung. Wohingegen 14 Tage nach der Immunisierung die Primärantwort der Mäuse mit Acetyltransferase-defizientem p300 ähnlich der von den Kontrollmäusen ist. Im Gegensatz dazu wird bei der Erinnerungsantwort eine schwächere Bildung von Ovalbumin-spezifischen Antikörpern detektiert. Da die Mäuse mit B-Zell-spezifischer Expression von Acetyltransferase-defizientem p300 nach Gabe des Antigens Ovalbumin eine B-Zell-Aktivierung zeigen, wird zusätzlich die Proliferation der B-Zellen ex vivo nach Aktivierung verschiedener Signalwege untersucht. Alleinig nach Induktion des BCR-Signalweges durch Zugabe von α-IgM zur Quervernetzung des BCR proliferieren die B-Zellen schwächer. Die reduzierte Anzahl proliferativer Zellen wird dabei nicht durch eine erhöhte Apoptose verursacht. Daher deutet dies auf eine Hemmung der Proliferation durch die fehlende Acetyltransferaseaktivität von p300 hin, welches unter anderem durch eine im cDNA-Microarray detektierte Deregulation des BCR-Signalweges verdeutlicht wird. Biochemische Analysen des Effektes von Acetyltransferase-defizientem p300 auf den Acetylierungsstatus der Proteine zeigen keine globalen oder promotorspezifischen Veränderungen der Histon H3K18-Acetylierung in B-Zellen mit reduzierter p300-Acetyltransferaseaktivität auf. Allerdings ist eine reduzierte Acetylierung bei größeren Proteinen als Histonen nachweisbar. Dies deutet darauf hin, dass vermutlich andere Proteine als Histone die kritischen Substrate der p300-Acetyltransferaseaktivität in vivo sind. Für weitere Analysen stellte ich eine B-Zelllinie her, in die durch homologe Rekombination das mutierte p300AS eingeführt wird. Diese B-Zelllinie synthetisiert nachweislich das mutierte p300AS, welches in vitro eine reduzierte Acetyltransferase-aktivität aufweist. Mit Hilfe der Zelllinie sind nun weitere Versuche, wie Proteomanalysen, zur Identifikation der Substrate, die auf die p300-Acetyltransferaseaktivität angewiesen sind, möglich

Untersuchungen zur Transaktivierung und Degradation des Nukleären Hormonrezeptors PPARγ

Nukleäre Hormonrezeptoren (NHRs) spielen eine bedeutende Rolle in einer großen Zahl physiologischer und pathologischer Vorgänge des menschlichen Organismus. Sie wirken als Transkriptionsfaktoren, deren Aktivität von Liganden reguliert wird. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) ist ein Mitglied der Familie der NHRs und hat unter anderem Einfluss auf die Adipogenese, die Regulation der systemischen Insulin-Sensitivität, den Fettstoffwechsel, die Tumor-Biologie und die Inflammation. PPARγ reguliert Gene, indem er als Heterodimer mit dem Retinoic X Rezeptor (RXR) an Promotorregionen bindet. Die in der Therapie des Diabetes Typ 2 als „Insulin-Sensitizer“ verwendeten Thiazolidinedione (TZDs), wie z.B. Rosiglitazon, sind hochpotente synthetische PPARγ-Liganden. Die Aktivierung von PPARγ durch Ligand führt aber auch zu einer Ubiquitinierung des Rezeptors mit nachfolgendem proteasomalen Abbau des Proteins. Aufgrund der verschiedenen Effekte von PPARγ wäre es von großer biologischer und therapeutischer Bedeutung, wenn es gelänge, die Aktivität dieses Transkriptionsfaktors selektiv zu beeinflussen. Dazu ist es notwendig, die Prozesse bei der Aktivierung von PPARγ genauer zu verstehen. In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob die ligandabhängige transkriptionelle Aktivität und Degradation miteinander gekoppelt sind. Für RXR wurden Punktmutanten beschrieben, deren Transaktivierung und Degradation unabhängig voneinander ablaufen. Ein Ziel dieser Arbeit war es, zu diesen RXR-Punktmutanten strukturgleiche, analoge PPARγ-Punktmutanten zu klonieren und zu charakterisieren. Es zeigte sich, dass bestimmte PPARγ-Punktmutanten eine reduzierte Affinität zu PPARγ-Ligand aufwiesen. Unter optimaler Ligandkonzentration wiesen alle PPARγ-Punktmutanten eine stark verringerte transkriptionelle Aktivität auf. In weiteren Versuchen zeigte sich, dass nur transkriptionell aktive PPARγ-Allele ligandabhängig abgebaut werden. Dagegen wurden die transkriptionell inaktiven PPARγ-Mutanten nicht abgebaut bzw. sogar stabilisiert. Zusammenfassend kann man daraus schließen, dass für PPARγ transkriptionelle Aktivität und Degradation notwendig miteinander gekoppelt sind. Weiterhin wurde in dieser Arbeit untersucht, auf welche Weise das Proteasom an der Regulation der transkriptionellen Aktivität von PPARγ beteiligt ist. Eine Reihe von Studien, die die transkriptionelle Aktivität von PPARγ mittels exogener Reporterkonstrukte maß, ergab, dass die Hemmung der Proteasomaktivität zu einer Steigerung der Transaktivierung von PPARγ führt. Demgegenüber konnte hier gezeigt werden, dass die ligandabhängige Expression von endogenen PPARγ-Zielgenen durch Proteasom-Inhibition gehemmt wird. Dies ist ein Hinweis darauf, dass anders als bisher vermutet die transkriptionelle Aktivierung der hier untersuchten endogenen Zielgene durch PPARγ die Aktivität des Proteasoms benötigt

Charakterisierung der E3 Ligase HectH9 und deren Einfluss auf cMyc und TopBP1

Das Protoonkogen c-myc kodiert für den Transkriptionsfaktor cMyc, der als Heterodimer mit Max die Transkription von Zielgenen aktiviert und als ternärer Komplex mit Max und Miz1 die Transkription einer zweiten Klasse von Zielgenen reprimiert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass HectH9, eine Ubiquitin E3 Ligase, endogen sowohl an cMyc als auch an Miz1 bindet. Miz1 wird im Gegensatz cMyc nicht von HectH9 modifiziert, kann aber die Ubiquitiniung von cMyc durch HectH9 inhibieren. Die Ubiquitinketten die HectH9 auf cMyc synthetisiert, sind über Lysin 63 verknüpft. Diese Modifikation führt nicht zu beschleunigtem Abbau von cMyc, sondern verändert dessen biologische Eigenschaften. Die Depletion von HectH9 durch shRNA reduziert die Fähigkeit von cMyc, Zielgene zu aktivieren. Die Repression von cMyc Zielgenen bleibt jedoch unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen sich in Experimenten mit Myc KR6, einer cMyc Mu- tante die nicht mehr von HectH9 ubiquitiniert werden kann, bestätigen. Die Aktivierungsdefizienz von Myc KR6 zeigt sich in einer FACS-Analyse durch fehlende Induktion von Zellteilung und Apoptose. Während wildtyp cMyc bei gehungerten 3T3 Zellen Zellzyklusprogression und Zelltot induziert, verhalten sich Myc KR6 infizierte Zellen vergleichbar zu Kontrollzellen. Die Ursache hier für liegt in der Notwendigkeit der Ubiquitinierung von cMyc für die Rekrutierung von p300 an cMyc aktivierte Promotoren. Obwohl wildtyp cMyc und Myc KR6 gleich effizient an Zielpromotoren assoziieren, kann lediglich wildtyp cMyc die Histonacetyltransferase p300 binden, welche notwendig für Rekrutierung von generellen Transkriptionsfaktoren ist. TopBP1 ist Bestandteil der DNA Schadenssignalkaskade und essentieller Aktiva- tor von ATR nach DNA Schadensinduktion durch UV-B Strahlung. Zellen, die Miz1 überexprimieren zeigen Anzeichen von DNA Schaden und weisen verlän- gerte Halbwertszeiten von TopBP1 und ATR auf. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von HectH9 die Halbwertszeit von TopBP1 nach UV-B Strahlung im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert und TopBP1 von HectH9 mit über Lysin 48 verknüpfte Polyubiquitinketten markiert wird. Diese Polyubiquitinierung wird von Miz1 gehemmt. Eine TopBP1 Mutante, die Miz1 nicht mehr binden kann, wird gegenüber wildtyp TopBP1 stärker ubiquitiniert und schneller abgebaut. Zusammenfassend wird deutlich, dass die E3 Ligase HectH9 entscheidend denZellzyklus vorantreibt, in dem sie durch Ubiquitinierung über Lysin 63 cMyc aktiviert und so die Zellzyklusprogression fördert und zusätzlich über Abbau von TopBP1 die Induktion von Zellzyklusarest reduziert. Diese onkogenen Ei- genschaften werden besonders im Kolonkarzinom deutlich. Während in normalen Darmgewebe HectH9 mRNA in nur 10% aller untersuchten Proben schwach nachzuweisen ist, ist in 80% aller untersuchten Adenokarzinome die HectH9 Transkription erhöht

Regulation der FOXO-Gene durch E2F-1und die induzierbare systemische Rekombination eines konditionellen Allels in der Maus

1.) FOXO1 und FOXO3A sind Zielgene von E2F-1 in Neuroblastomzellen. 2.) In einem Mausstamm, der ubiquitär ein CRE-ER Fusionsprotein exprimiert, konnte nach Tamoxifen Gabe die Rekombination des konditionellen mutierten p300 AS Gens in der untersuchten Geweben des entsprechenden Mausstammes nachgewiesen werden. Auf Basis dieses Experimentes kann nun die Tumorsuppressor von p300 in vivo untersucht werden

Identifizierung von Inhibitoren der Wachstumsarrest induzierenden Funktion von Miz1 und Charakterisierung von 14.3.3eta als Inhibitor der Funktion von Miz1

Der mit Myc interagierende Transkriptionsfaktor Miz1 wird für die transkriptionelle Aktivierung der Cdk-Inhibitoren p15Ink4b und p21Cip1 benötigt. Durch die Aktivierung dieser Gene induziert Miz1 in Zellen einen Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus. Myc inhibiert die Miz1-abhängige Induktion des G1-Arrestes durch Ausbildung eines Komplexes mit Miz1, wodurch Myc die Transaktivierungsaktivität von Miz1 hemmt. In der vorliegenden Arbeit wird ein retrovirales Screen-Verfahren beschrieben, daß mit dem Ziel durchgeführt wurde neue Gene zu identifizieren und charakterisieren, die für Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 kodieren. Dazu wurde eine humane cDNA-Expressionsbibliothek retroviral in Rat1- Fibroblastenzellen infiziert, die zusätzlich mit Miz1 exprimierenden Retroviren superinfiziert wurden. Der eingesetzte Titer der Miz1 exprimierenden Retroviren, führte zu einem vollständigen Wachstumsarrest in parentalen Rat1-Fibroblasten. Die Identität der cDNA-Insertionen der erhaltenen Zellklone wurde mittels PCR-Technik und Sequenzierung ermittelt. Es wurde insgesamt siebenmal eine für c-Myc kodierende cDNA und zweimal eine für ein Fragment des gamma Actin kodierende cDNA isoliert. Es konnte in allen analysierten Zellklonen eine bestehende ektopische Expression von Miz1 nachgewiesen werden. Die Isolierung vollständiger Gensequenzen mit einer Inhibitionsfunktion demonstrieren, daß das durchgeführte Screen-Verfahren technisch gut funktioniert hat. Jedoch führte die Ermittlung der cDNAs als humane c-Myc Sequenzen als Inhibitor des Miz1 induzierten Wachstumsarrestes nicht zu neuen Erkenntnissen, da diese Interaktion bereits bekannt und untersucht war (Peukert et al., 1997). Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von 14.3.3eta, als Inhibitor der Funktion von Miz1. Dabei handelt es sich um eine Isoform der 14.3.3 Proteinfamilie, die in Säugern insgesamt neun Mitglieder umfaßt. 14-3-3eta wurde als potentieller Kandidat in einem anderen retroviralen Screen-Verfahren gefunden, das ebenfalls zur Identifizierung neuer Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 durchgeführt wurde. Dazu wurde eine retrovirale cDNA-Expressionsbibliothek eingesetzt, um gezielt nach Inhibitoren zu suchen, die das langsame Wachstum von Zusammenfassung 124 Miz-1 überexprimierenden Rat1-Fibroblastenzellen überwinden können. Die Überexpression von 14-3-3eta hemmt den Miz1-induzierten Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus durch Inhibition der Miz1-abhängigen Genaktivierung der der Cdk-Inhibitoren p15INK4B und p21CIP1, ähnlich wie Myc und TopBP1. Darüber hinaus antagonisiert 14.3.3eta auch die Apoptose in Rat1-Fibroblsaten, die durch eine Überexpression von Miz1 induziert wird. Es konnten in der Sequenz von Miz1 zwei potentielle Bindemotive für die Bindung von 14.3.3 Proteinen, sogenannte Mode I Motive, ermittelt werden, die in der Nähe und innerhalb der DNA-bindenden Domäne liegen. In dem ersten Motiv befindet sich an Position 291 ein phosphorylierbares Threonin und im zweiten Motiv an Position 428 ein phosphorylierbares Serin. 14-3-3eta bindet über diese beiden Motive direkt an Miz1. Punktmutanten von Miz1, die nicht mehr an 14-3-3eta binden können, demonstrieren, daß die Hemmung der Miz1-abhängigen Genaktivierung von p21Cip1 und p15Ink4b durch 14-3-3eta von den beiden Erkennungsmotiven abhängt. Dabei ist die Hemmung von der Phosphorylierung der Aminosäuren Threonin291 und Serin428 abhängig. Mechanistisch erfolgt die Hemmung von Miz1, indem 14-3-3eta die Bindung von Miz1 an die Initiator Elemente der Zielgen-Promotoren verhindert. Die zelluläre Lokalisation von Miz1 wird durch die Interaktion mit 14-3-3eta nicht verhindert. Die Vorraussetzung der Interaktion von 14-3-3eta mit seinen Liganden ist die Phosphorylierung der Serin/ Threonin Reste in den Erkennungsmotiven. Die Phosphorylierung des Serin428 in Miz1 erfolgt durch die Akt/ PKB Kinase und ist notwendig für die Interaktion von 14-3-3eta und Miz1 und die daraus resultierende Inhibition der Funktion von Miz1. Genexpressionsanalysen zeigten, daß Miz1 zwei veschiedene Funktionen in der Regulation der Genexpression besitzt. Zum einen ist Miz1 für die nach DNASchädigung erfolgende Aktivierung einer großen Gruppe von Genen notwendig. Diese Funktion wird durch Myc, aber nicht durch Akt/ 14-3-3eta reguliert. Zum anderen reprimiert Miz1 eine Gruppe von Genen nach Schädigung der DNA. Diese reprimierende Funktion wird durch Akt/ 14-3-3eta aber nicht durch Myc reguliert. Die Akt-abhängige Phosphorylierung von Miz1 und die darauf folgende Bindung von 14-3-3eta scheint in der Regulation des Zellzyklusarrestes während der DNA-Schadensantwort eine wichtige Rolle zu spielen