SOTTODOMINI DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO IN FISIOLOGIA E PATOLOGIA

The endoplasmic reticulum, the largest organelle of eukariotic cells, presents a very complex architectonical organization that reflects its several functions. It is now well known how this organelle presents many sub-domains to exploit particular functions, such as transport throughout the secretory pathway and degradation of misfolded proteins; sub-domains in the ER can be created also after pathological events. My Thesis project is dedicated to characterize two sub-domains of the endoplasmic reticulum, one correlated to pathology, and another one commonly present in healthy cells. Regarding the sub-domain generated in pathological context, I studied VAPB, a membrane protein with a C-terminal anchor (\u201ctail-anchored\u201d), which is resident in the endoplasmic reticulum, whose P56S mutation induces large perinuclear inclusions formation. Considering that such aggregates haven\u2019t still clearly related to any cellular organelle, I decided to study the biogenesis of the wild-type and mutated protein both in vivo and in vitro, and characterize mutant protein generated aggregates. In vitro assays are based on the N-glycosilation of an epitope anchored to the C-terminus of the protein and also on protease protection assays developed in my laboratory, while in vivo experiments are aimed to the morphological evaluation of the inclusions induced by the mutant protein. With such approaches we have demonstrated that both the wild type form and the mutant one insert the membrane of the endoplasmic reticulum, following the post-translational pathway, and the in vitro behaviour of the mutant is indistinguishable from the one of the wild type. However, in vivo, at very early times from the insertion into the endoplasmic reticulum (2 hours), P56S-VAPB organizes into small clusters that then fuse to form large paranuclear inclusions. Such inclusions are positive for some endoplasmic reticulum markers, while they result negative for markers of other organelles. The inclusion continuity with the surrounding endoplasmic reticulum has been demonstrated with FRAP and FLIP analysis. The ultrastructural analysis demonstrated that the inclusions consist of pair of cisternae intermingled by a cytosolic layer of approximately 30 nm. This form of OSER is probably generated by high affinity trans interactions between the cytosolic domains of P56S-VAPB. These results demonstrate that P56S-VAPB causes a dramatic remodelling of the endoplasmic reticulum that can explain the neurotoxic action of the protein. Regarding the role of endoplasmic reticulum sub-domains in physiology, I focused on a possible role of lipid microdomains in the segregation and plasma membrane transport of membrane proteins. As models for my study I used an endoplasmic reticulum resident protein, cytochrome b5, and an its variant, b5-22, different from the wild-type protein only for its transmembrane domain extended of only 5 aminoacids. Previous studies in my laboratory demonstrated that the b5-22 variant inserts initially in the endoplasmic reticulum, but then it distributes disomogenously within the organelle, concentrating into the tubules and into the exit sites. To investigate the possible role of lipid microdomains in such event, I developed an experimental approach based on the use of radiolabelled, photoactivable lipid probes and I so analyzed the lipid environment of the endoplasmic reticulum in the proximity of b5 wild type and b5-22. With such approach I observed that b5-22 is less accessible to phosphatidylcholine in comparison to the wild-type. This observation suggests that b5-22 distributes into microdomains that are poor of phosphatidylcholine and so enriched of another lipid. Such segregation could lead to the concentration of b5-22 into the exit sites and so the its export from the endoplasmic reticulum. The results obtained illustrate how protein-lipid interactions based on simple physical-chemical parameters can determine the fate of a protein throughout the secretoty pathway

A time-varying inertia pendulum: Analytical modelling and experimental identification

In this paper two of the main sources of non-stationary dynamics, namely the time-variability and the presence of nonlinearity, are analysed through the analytical and experimental study of a time-varying inertia pendulum. The pendulum undergoes large swinging amplitudes, so that its equation of motion is definitely nonlinear, and hence becomes a nonlinear time-varying system. The analysis is carried out through two subspace-based techniques for the identification of both the linear time-varying system and the nonlinear system. The flexural and the nonlinear swinging motions of the pendulum are uncoupled and are considered separately: for each of them an analytical model is built for comparisons and the identification procedures are developed. The results demonstrate that a good agreement between the predicted and the identified frequencies can be achieved, for both the considered motions. In particular, the estimates of the swinging frequency are very accurate for the entire domain of possible configurations, in terms of swinging amplitude and mass positio

A Mechanism for Chronic Filarial Hydrocele with Implications for Its Surgical Repair

Chronic hydrocele is the accumulation of fluid around the testis leading to an increase in the volume of the scrotal contents. Depending on the volume of fluid, hydrocele can be disfiguring and even incapacitating. Chronic hydrocele has multiple etiologies, but irrespective of the cause, surgery is the standard form of treatment and this can be done using different surgical techniques. The prevalence of chronic hydrocele in bancroftian filariasis endemic areas—a parasitic disease transmitted by mosquito—is very high and represents the most common clinical manifestation of bancroftosis, following by swollen legs of lower limbs or lymphedema among women. In Greater Recife, northeastern, Brazil, a bancroftian filariasis endemic area, a pioneering, prospective surgical study proposes a new mechanism for filarial-induced hydrocele and presents evidence that the filarial hydrocele fluid may damage the testis. Thus, based on the findings presented, the authors propose that in bancroftian filariasis endemic areas hydrocele patients should be operated on using a specific surgical technique in order to avoid recurrence of the disease, and consequently, additional damage to the testicle

Studio della biogenesi della proteina tail-anchored VAP-B e di una sua forma mutata associata alla sclerosi lateale amiotrofica

Le proteine tail-anchored (TA) sono una classe di proteine transmembrana caratterizzate da un dominio citosolico N-terminale e un singolo dominio transmembrana al C-terminale. A causa della loro particolare topologia, le TA non seguono il sistema co-traduzionale SRP/Sec61-dipendente per inserirsi nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER), ma un meccanismo post-traduzionale di cui molti aspetti sono ancora da caratterizzare. Recentemente \ue8 stato dimostrato che esistono due vie di inserzione per queste proteine: una, chiamata assistita, che necessita di chaperone, ATP e un recettore di membrana, e una chiamata non assistita , attraverso la quale alcune proteine TA possono inserirsi spontaneamente nel doppio strato lipidico. In questo mio primo anno di Dottorato ho studiato la biogenesi di VAP-B, una proteina TA residente dell'ER, e della sua forma mutata VAP-B P56S, che studi recenti riportano essere associata a una forma di sclerosi laterale amiotrofica a insorgenza tardiva chiamata ALS8 (Nishimura et al., 2004). Per determinare se VAP-B \ue8 una TA che si inserisce nella membrana dell\u2019ER in maniera non assistita oppure in maniera assistita, ho utilizzato il saggio di protezione da proteasi messo a punto nel nostro laboratorio (Brambillasca et al., 2005; Brambillasca et al., 2006). I risultati hanno dimostrato che VAP-B si inserisce nell'ER in modo assistito: la proteina infatti trasloca in microsomi ma non in vescicole di soli lipidi. La traslocazione risulta inoltre inefficiente, se confrontata con altre TA studiate nel laboratorio, quali il citocromo b5 (b5) (Brambillasca et al., 2005). Ho studiato quindi se \ue8 il transmembrana (TM) di VAP-B a giocare un ruolo nel determinare la bassa efficienza di traslocazione. Ho sostituito quindi vicendevolmente i TM di VAP-B e del b5, creando le due proteine chimeriche b5 TM VAP-B e VAP-B TM b5. Come atteso, ho osservato un miglioramento nella traslocazione della chimera VAP-B TM b5 e un peggioramento per la chimera b5 TM VAP-B; questo indica quindi che il TM di VAP-B \ue8 molto importante nel determinare la sua bassa efficienza di inserimento nell\u2019ER. Dato che VAP-B possiede due sequenze di dimerizzazione, una all'interno del dominio TM e l'altra immediatamente a monte di quest'ultimo, ho studiato se la bassa efficienza di traslocazione della proteina pu\uf2 essere determinata anche da previa aggregazione per via delle due sequenze. Mutandole, tuttavia, non si osserva alcun miglioramento nella traslocazione di VAP-B. Passando quindi allo studio della biogenesi di VAP-B P56S, non ho notato alcuna differenza rilevante nel comportamento di traslocazione della proteina rispetto al wild-type; questo significa che la proteina mutata non provoca alcuna anomalia nell\u2019inserzione nella membrana dell\u2019ER di VAP-B. Tuttavia, overesprimendo per 24 ore VAP-B P56S in cellule CV1 si osservano grossi aggregati di proteina, al contrario di quello che si osserva per la forma wild-type che si distribuisce diffusamente nell'ER. Ho notato inoltre che in alcune cellule, a fasi precoci dell'espressione, VAP-B P56S \ue9 diffusa nell'ER analogamente al wild-type; si suppone quindi che la formazione di aggregati avvenga solo in fasi successive alla normale inserzione della proteina nella membrana dell\u2019ER, confermando quindi i dati gi\ue0 ottenuti nei saggi in vitro. Per quanto riguarda la caratterizzazione degli aggregati, si osserva che essi colocalizzano con il marker generale dell'ER mVENUS-ER e con il marker del lume dell'ER PDI; sezioni sull'asse z mostrano inoltre come la colocalizzazione tra gli aggregati e la PDI si estende per tutta l'altezza dell'aggregato. Non si osserva invece colocalizzazione con il marker dell'ER rugoso Sec61\u3b2, con il marker del Golgi giantina e con il colorante acidofilo Lyso-tracker, marker della via endo-lisosomiale. In conclusione, nel mio primo anno di Dottorato ho osservato che la TA VAP-B si inserisce con un meccanismo di tipo assistito nella membrana dell'ER, ma poco efficientemente. La bassa efficienza di traslocazione pu\uf2 essere ricondotta al tipo di dominio TM che la proteina possiede, ma non ad aggregazione antecedente l'inserzione in membrana. VAP-B P56S nei primi stadi della sua biogenesi si comporta allo stesso modo della forma wild-type, ma in fasi successive forma aggregati che sembrano originare dall'ER, presumibilmente dall'ER liscio