A Computational Study of Elongation Factor G (EFG) Duplicated Genes: Diverged Nature Underlying the Innovation on the Same Structural Template

BACKGROUND: Elongation factor G (EFG) is a core translational protein that catalyzes the elongation and recycling phases of translation. A more complex picture of EFG's evolution and function than previously accepted is emerging from analyzes of heterogeneous EFG family members. Whereas the gene duplication is postulated to be a prominent factor creating functional novelty, the striking divergence between EFG paralogs can be interpreted in terms of innovation in gene function. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We present a computational study of the EFG protein family to cover the role of gene duplication in the evolution of protein function. Using phylogenetic methods, genome context conservation and insertion/deletion (indel) analysis we demonstrate that the EFG gene copies form four subfamilies: EFG I, spdEFG1, spdEFG2, and EFG II. These ancient gene families differ by their indispensability, degree of divergence and number of indels. We show the distribution of EFG subfamilies and describe evidences for lateral gene transfer and recent duplications. Extended studies of the EFG II subfamily concern its diverged nature. Remarkably, EFG II appears to be a widely distributed and a much-diversified subfamily whose subdivisions correlate with phylum or class borders. The EFG II subfamily specific characteristics are low conservation of the GTPase domain, domains II and III; absence of the trGTPase specific G2 consensus motif "RGITI"; and twelve conserved positions common to the whole subfamily. The EFG II specific functional changes could be related to changes in the properties of nucleotide binding and hydrolysis and strengthened ionic interactions between EFG II and the ribosome, particularly between parts of the decoding site and loop I of domain IV. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Our work, for the first time, comprehensively identifies and describes EFG subfamilies and improves our understanding of the function and evolution of EFG duplicated genes

Meccanismi di regolazione dell'attività della superossido dismutasi in micro-organismi estremofili ed in mitocondri

Scopo del presente programma di ricerca è lo studio delle proprietà delle superossido dismutasi isolate dall'eubatterio psicrofilo Pseudoalteromonas haloplanktis (PhSOD) e da mitocondri animali (mitSOD). Insieme alla SOD dell'archeobatterio ipertermofilo Sulfolobus solfataricus (SsSOD), già disponibile ed ampiamente caratterizzata anche in alcune sue forme mutate (1-4), questi enzimi sono membri della stessa famiglia di SOD, che svolge un ruolo primario nel controllo del livello dei ROS in tutte le forme viventi. I tre enzimi possono quindi essere impiegati come modelli per studiare l'evoluzione della funzione antiossidante della SOD. Alcune precedenti ricerche sulla SsSOD e sulla mitSOD umana fanno supporre che l'attività di tale enzima ubiquitario possa essere soggetta a regolazione. Pertanto nella ricerca sarà data particolare enfasi all'individuazione di eventuali meccanismi di regolazione dell'espressione e dell'attività di tale enzima, anche mediante l'uso di colture cellulari. Infine, le tre SOD considerate funzionano in condizioni di temperatura molto diverse che vanno dai 4 - 20°C di P. haloplanktis fino agli 87°C di S. solfataricus. Pertanto questi modelli di enzimi estremofili sono anche utili per avere indicazioni sui meccanismi attraverso cui l'enzima si è evoluto per funzionare in organismi mesofili. La ricerca tratterà quindi le seguenti tematiche: 1. CARATTERIZZAZIONE DI UNA SUPEROSSIDO DISMUTASI PSICROFILA 2. REQUISITI STRUTTURALI PER L'ADATTAMENTO DELLE SOD A TEMPERATURE ESTREME 3. ESPRESSIONE ETEROLOGA DEL GENE PER LA SOD MITOCONDRIALE DI RATTO E DI SUE FORME MUTATE 4. MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA SOD MITOCONDRIAL

Meccanismi molecolari e controllo dello stato redox in seguito all'infezione da Helicobacter pylori

Il microrganismo Helicobacter pylori, responsabile di varie patologie quali gastriti e ulcere, colonizza la mucosa gastrica grazie all’adattamento alla crescita nell’ambiente acido dello stomaco. L’infezione può rimanere a lungo asintomatica e, se non riconosciuta ed eradicata con opportune terapie antibiotiche, può essere responsabile dello sviluppo di adenocarcinomi e linfomi gastrici. Nei tessuti colonizzati dal batterio si osserva una forte risposta infiammatoria con incremento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché riduzione dei livelli di ossido nitrico, un importante protettore della mucosa gastrica. Pur essendo un microaerofilo, H. pylori è ben adattato alla difesa contro i ROS, essendo dotato di efficienti sistemi enzimatici di difesa, come la superossido dismutasi (HpSOD). D’altra parte, al processo infiammatorio partecipa il peptide Hp(2-20), un fattore chemiotattico secreto da H. pylori, che manifesta le sue proprietà antibatteriche grazie all’induzione della produzione di ROS da parte della NADPH ossidasi dei neutrofili. Con questo progetto si studieranno alcuni aspetti molecolari e funzionali relativi all’infezione da H. pylori, approfondendo il significato di alcune specifiche proprietà strutturali e funzionali di HpSOD e caratterizzando alcuni meccanismi molecolari coinvolti nel controllo del potenziale redox in linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, anche dopo stimolazione con Hp(2-20). E’ noto che HpSOD, l’enzima chiave per la detossificazione dall’anione superossido, possiede, diversamente da altre Fe- e Mn-SOD, un’estensione amminoacidica nella regione C-terminale, il cui ruolo è però ancora sconosciuto; inoltre, in alcune condizioni di crescita l’enzima si ancora al rivestimento flagellare del batterio; infine, l’attività di HpSOD probabilmente contribuisce alla riduzione dei livelli di NO nello stomaco. Un obiettivo della ricerca riguarderà lo studio del ruolo dell’estensione C-terminale dell’enzima nel meccanismo di patogenicità. In particolare, grazie alla disponibilità di una forma ricombinante di HpSOD, si identificheranno eventuali modifiche covalenti a carico di residui dell’estensione C-terminale della HpSOD, ma anche di altri regioni dell’enzima, che giocano un ruolo nella relazione struttura-funzione di HpSOD. Tra le modifiche covalenti da ricercare saranno particolarmente studiate la nitrazione, la S-glutationilazione e la fosforilazione, anche perché già riportate per altre SOD. Un altro aspetto riguarda la possibile reattività nei riguardi di agenti modificanti di un residuo di cisteina (C189) localizzato nella regione C-terminale della HpSOD. Infatti la presenza di HpSOD sulla superficie cellulare del batterio renderebbe possibile l’interazione dell’enzima con componenti cellulari secreti dalla mucosa infiammata, che potrebbero portare alla farnesilazione o acilazione della HpSOD. Questo tipo di modifica, che coinvolge residui di cisteina della regione C-terminale, consente l’ancoraggio di altre proteine alla membrana plasmatica. Per tutte le modifiche identificate, si procederà alla valutazione degli effetti biochimici (attività specifica, sensibilità ad inibitori ed inattivatori, termostabilità), nonché a stabilire il loro eventuale ruolo nell’ancoraggio dell’enzima al rivestimento flagellare del batterio. Infine, sarà avviato un progetto di mutagenesi che miri a definire il ruolo dei residui della regione C-terminale di HpSOD, producendo anche una forma troncata dell’enzima priva di tale estensione. E’ già noto che l’effetto stimolatorio di Hp(2-20) sulla NADPH ossidasi di neutrofili è mediato dal legame del peptide ai recettori per formil-peptidi (FRP). Si cercherà di caratterizzare i meccanismi molecolari responsabili della generazione di superossido da parte della NADPH ossidasi in due linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, MKN-28 e AGS, nonché in biopsie di pazienti con infezione cronica da H. pylori. Saranno ricercati i partners molecolari della cascata di segnalazione responsabile dell’incremento del processo di proliferazione cellulare, identificando innanzitutto i membri della famiglia dei recettori per formil-peptidi e la componente catalitica (Nox) della NADPH ossidasi espressa in queste cellule. Tale identificazione fornirà importanti informazioni sulla cascata intracellulare coinvolta nella regolazione delle varie isoforme di Nox, in seguito all’interazione Hp(2-20)/FPR. Successivamente saranno studiati i meccanismi di attivazione di Nox, analizzando le chinasi responsabili della fosforilazione e della traslocazione della subunità regolatoria di questo enzima, nonché i pathways responsabili della proliferazione cellulare in queste linee tumorali. Infine si valuterà anche la capacità di Hp(2-20) di attivare i fattori trascrizionali STAT3 e HIF-1alfa, responsabili dell’ aumento della trascrizione, e quindi della sintesi del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), promuovendo così l’angiogenesi

Proprietà molecolari e funzionali della superossido dismutasi in micro-organismi estremofili e in mitocondri

Con il presente programma si intendono approfondire le conoscenze sulle proprietà strutturali e funzionali della superossidodismutasi (SOD) isolata da micro-organismi estremofili e da mitocondri. Negli organismi aerobi la SOD è certamente uno dei componenti cellulari più studiati e caratterizzati tra quelli coinvolti nella difesa dall'azione dannosa dei radicali tossici denominati ROS (reactive oxygen species). D'altra parte il meccanismo di protezione dal superossido non è solo ristretto agli organismi aerobi, essendo tale enzima presente anche negli anaerobi e perfino in organismi adattati a condizioni estreme di crescita. La SOD quindi rappresenta un ottimo modello per l'analisi del rapporto struttura-funzione nelle proteine, nonché per studiare l'evoluzione delle funzioni di questo enzima nel corso della filogenesi. La ricerca verterà sullo studio della SOD dall'archeobatterio ipertermofilo Sulfolobus solfataricus e da mitocondri di ratto. Le SOD isolate da queste due fonti appartengono alla stessa famiglia delle Fe- o Mn-SOD ed hanno numerose proprietà strutturali e funzionali comuni. Inoltre è stata avanzata un'ipotesi evoluzionistica che accomunerebbe queste due sorgenti, essendo il genere Sulfolobus il putativo ancestore dei mitocondri animali. Le competenze e l'esperienza già acquisita in questo laboratorio sulla Fe-SOD isolata da S. solfataricus saranno di grande aiuto per estendere le conoscenze sul ruolo e sulle funzioni della Mn-SOD da mitocondri di ratto (r-mitSOD). La ricerca verterà sulle seguenti tematiche. 1. ESPRESSIONE ETEROLOGA DEL GENE PER LA SOD MITOCONDRIALE DI RATTO 2. INDIVIDUAZIONE ED ANALISI DI AGENTI MODIFICANTI DELLA SOD DA S. SOLFATARICUS E MITOCONDRI 3. ANALISI DI FORME MUTATE DELLA SOD DA S. SOLFATARICUS E DA MITOCONDRI 4. SUPEROSSIDO DISMUTASI PSICROFIL

The elongation factor G carries a catalytic site for GTP hydrolysis, which is revealed by using 2-propanol in the absence of ribosomes

In the absence of ribosomal particles, elongation factor G (EF-G) promotes very little GTP hydrolysis. After the addition of some aliphatic alcohols to EF-G, the rate of nucleotide cleavage was significantly increased and GTPase activity was easily detectable. The highest stimulation, nearly 16-fold, occurred with 2-propanol at a 20% (v/v) concentration. The reaction showed the characteristics of an enzymatic catalysis, but the rate was three orders of magnitude lower than that of the ribosome-dependent EF-G GTPase activity. Striking similarities between the two activities indicated that the catalysis stimulated by the alcohol was due to EF-G itself. We found that EF-G GTPase activity in the presence of 2-propanol displayed an absolute specificity for GTP as in the presence of ribosomes; the two activities copurified to a constant ratio and exhibited coincident chromatographic and electrophoretic patterns; the temperature for the half-inactivation of EF-G was 59.3 degrees C for both GTPase systems, as well as the kinetic constant for the thermal inactivation process which was found to be 0.05 min-1; and the Km for the GTP in the presence of 2-propanol (59 microM) was similar to that found in the presence of ribosomes. These results indicate that the EF-G molecule carries a catalytic site for GTP hydrolysis, which in the absence of ribosomal particles is activated by an appropriate alcohol/water surrounding medium

The elongation factor G carries a catalytic site for GTP hydrolysis, which is revealed by using 2-propanol in the absence of ribosomes

In the absence of ribosomal particles, elongation factor G (EF-G) promotes very little GTP hydrolysis. After the addition of some aliphatic alcohols to EF-G, the rate of nucleotide cleavage was significantly increased and GTPase activity was easily detectable. The highest stimulation, nearly 16-fold, occurred with 2-propanol at a 20% (v/v) concentration. The reaction showed the characteristics of an enzymatic catalysis, but the rate was three orders of magnitude lower than that of the ribosome-dependent EF-G GTPase activity. Striking similarities between the two activities indicated that the catalysis stimulated by the alcohol was due to EF-G itself. We found that EF-G GTPase activity in the presence of 2-propanol displayed an absolute specificity for GTP as in the presence of ribosomes; the two activities copurified to a constant ratio and exhibited coincident chromatographic and electrophoretic patterns; the temperature for the half-inactivation of EF-G was 59.3 degrees C for both GTPase systems, as well as the kinetic constant for the thermal inactivation process which was found to be 0.05 min-1; and the Km for the GTP in the presence of 2-propanol (59 microM) was similar to that found in the presence of ribosomes. These results indicate that the EF-G molecule carries a catalytic site for GTP hydrolysis, which in the absence of ribosomal particles is activated by an appropriate alcohol/water surrounding medium

Archaebacterial elongation factor 1a carries the catalytic site for GTP hydrolysis

The elongation factor 1 alpha from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus (aEF-1 alpha) possesses an intrinsic GTPase activity that is triggered by NaCl up to 5.2 M and requires the presence of at least 1 mM MgCl2 or MnCl2. Chloride salts of other monovalent cations are inefficient, whereas other sodium salts are much less efficient or not efficient at all as compared with NaCl. This aEF-1 alpha GTPase (GTPaseNa) reaches a maximum in a broad pH range and is not affected by other nucleoside triphosphates but is competitively inhibited by GDP. The turnover of GTPaseNa is rate limited by the breakdown of GTP. The Km for GTP is in the range of 2.2-9.3 microM, depending on the NaCl concentration and temperature. The highest catalytic efficiency is reached at 87 degrees C, which is the optimum temperature for growth of S. solfataricus. The energetic parameters of GTPaseNa are similar to those reported in the literature for the GTPase of Escherichia coli elongation factor Tu (EF-Tu) triggered by 2 M KCl, thus suggesting that the GTPase activity supported by either EF-Tu or aEF-1 alpha undergoes a similar mechanism of activation by salt at high concentration. A molecular mechanism for this activation is proposed

THE GLUTATHIONE BIOSYNTHESIS IN THE PSYCHROPHILE PSEUDOALTEROMONAS HALOPLANKTIS

Glutathione (GSH) plays a relevant role in the control of redox homeostasis even in philogenetically distant microbial species. The presence of GSH was recently hypothesized even in cold-adapted sources, on the basis of the effects produced by this thiol on some antioxidant enzymes from Pseudoalteromonas haloplanktis, a psychrophile isolated from the Antarctic sea. The possible existence of an enzyme system aimed at GSH biosynthesis in P. haloplanktis was investigated. This biochemical process involves the activity of the enzymes glutamyl-cysteine ligase (GshA) and glutathione synthetase (GshB). In the genome of P. haloplanktis two putative genes encoding GshA (PhGshAI and PhGshAII) and one encoding GshB (PhGshB) were identified. In order to characterize the first enzyme system for GSH biosynthesis in a psychrophilic source, recombinant forms of PhGshAII and PhGshB were obtained. It is known that each step leading to GSH from glutamate, cysteine and glycine involves the hydrolysis of one ATP molecule. Therefore, a convenient assay for determining the activity of each enzyme was set up, using the radiolabelled compound [γ32P]ATP. Concerning rPhGshB, the pH optimum of the activity was between 7.5 and 7.8. The affinity for ATP in the temperature range 10-30°C was evaluated. rPhGshB showed a significant activity even at low temperatures, whereas the Km ranges between 0.14 and 0.25 mM in the 10-30°C temperature range. The kcat values were analysed through the Arrhenius equation and the calculated energy of activation was 77 kJ/mol, a value unusually high for a psychrophilic enzyme. The heat inactivation profile of rPhGshB allowed the determination of a half-life of 10 min at 50.5°C, a value high for a psychrophilic enzyme, although not unusual for antioxidant enzymes. The energy of activation related to the inactivation process was 208 kJ/mol, as usually found for psychrophilic enzymes. The research is now focused on the characterization of rPhGshAII

Effect of propan-2-ol on enzymic and structural properties of elongation factor G

ElongationfactorG (EF-G)can supporta GTPaseactivityinvitroeven intheabsenceofribosomeswhen propan-2-olispresent[GTPaseP;DeVendittis,Masullo& Bocchini(1986)J.Biol.Chem.261,4445-4450]. InthepresentworktheGTPasePactivityofEF-Gwas furtherstudiedbyinvestigating(i)theeffectofionic environmenton GTPasePand(i)theinfluenceofpropan-2-olon themolecularstructureofEF-Gas determinedbyfluorescenceandc.d.measurements. Inthepresence of1-300mm univalentcations(M+) alone,no detectableGTPasePactivitywas measured;however,inthepresence of1 mM-Mg2" a considerable stimulationwasobservedat40mM-Li'or75mM-NH4+.Amongbivalentcations(M2+),1 mM-Sr2+,2-5mM- Ca2'and1 mM-Ba2+were themosteffective,but,inthepresence of75mM-NH4+,Mg2+andMn2+became themosteficient,whereasthestimulationbyotherM2+specieswas considerablydecreased.C.d. measurementsshowedthatthealcoholincreasedthemean molarresidueelipticityofEF-Gat285nm, but notat220nm.Asestimatedfromfluorescencemeasurements,inthepresenceof20 (v/v)propan-2-olthe value of the dissociation constant of the complex formed between EF-G and 8-anilino-1 -naphthalene- sulphonatedecreasedfrom8to5/tM; similarly,thenumberofbindingsiteson EF-Gforthefluorescent probe decreased from 13 to 6. Finally, the alcohol enhanced the quenching of the intrinsic fluorescence of EF-G caused by either acrylamide or KI. The data support the hypothesis that propan-2-ol induces moderateconformationalchangesofEF-Gthatmakethecatalyticcentreaccessibletothesubstrateeven in the absence of ribosomes. Kinetics of GTPaseP studied at different temperatures did not reveal additional structuralchangesofEF-Goccurringwithtimeor temperature