Inhibitors of p53 and HIF-prolyl-4-hydroxylases provide mitochondrial protection in a model of oxytosis

Mitochondrial dysfunction and demise are hallmarks of many neurological disorders and neurodegenerative diseases. Since mitochondria are the key organelles providing energy, they are regarded as the power house of the cell. Under conditions of stress, mitochondria regulate the ‘point of no return’ in intrinsic cell death pathways, which marks the decision point between life and death. Once the mitochondria are irretrievably damaged, they drive the cell into death. Mitochondrial protection displays a promising strategy to protect neurons from death. Previously, the two proteins p53 and PHD1 have been associated with neurodegeneration. Hence, the aim of this study was to investigate the role of those two proteins in neuronal cell death and to evaluate the neuroprotective potential of their particular inhibitors PFTα and DFO, DHB, CPO and oxyquinoline, respectively. Additionally, underlying mechanisms should be elucidated by which these inhibitors mediate their neuroprotective effects. In this study, immortalised mouse hippocampal HT-22 cells were used since they represent an established model of caspase-independent cell death induced by glutamate, termed oxytosis. Moreover, erastin was applied in the same cell line to induce a mode of cell death called ferroptosis. The first part of this study revealed that siRNA-mediated knockdown of p53 delayed glutamate-induced cell death in HT-22 cells for about 2 h, but failed to prevent lipid peroxidation or mitochondrial damage depicted as enhanced mitochondrial fragmentation, depolarisation of the mitochondrial membrane, increased mitochondrial ROS formation and a loss of ATP levels. Both p53 and phospho-p53 did not translocate to the mitochondria upon glutamate challenge indicating that oxytosis was not attributed to a direct action of p53 at the level of mitochondria. The inhibition of p53 transcriptional activity by knockdown of p53, which was determined by a reporter assay established in this work, could serve as a possible explanation for the observed delay of cell death. In contrast, the pharmacological p53-inhibitor PFTα prevented glutamate-induced cell death of HT-22 cells more efficiently and was still able to rescue these cells when applied up to 4 h after the onset of glutamate treatment. Furthermore, PFTα abolished lipid peroxidation and subsequently preserved mitochondrial integrity which was indicated by reduced mitochondrial fission, attenuated formation of mitochondrial ROS and restored mitochondrial membrane potential and ATP levels. Notably, PFTα rescued HT-22 cells depleted of p53 from glutamate-induced cell death. These results exposed a pronounced neuroprotective potential of PFTα which occurred at the level of mitochondria and independently of p53. The second part of this thesis demonstrated the neuroprotective potential of PHD inhibition by the use of structural diverse PHD-inhibitors and siRNAs selectively targeting PHD1. Both concepts of PHD inhibition reduced generation of lipid peroxides and preserved mitochondrial morphology and function indicated by restored mitochondrial respiration and membrane potential and abolished mitochondrial ROS formation, revealing that PHD inhibition acts upstream of mitochondrial demise. Remarkably, the effects by siRNA-mediated PHD1 silencing were less pronounced than those achieved by pharmacological inhibitors. These differences in efficacy were likely attributed to the insufficient knockdown by the siRNA approach. Nevertheless, these findings exposed the selective inhibition of PHD1 and the broad pharmacological inhibition of the PHD enzyme family as promising strategies to achieve mitochondrial rescue and subsequent neuroprotection. Previously, PHDs have been shown to interact with the transcription factor ATF4. The present study revealed that oxyquinoline was able to prevent the glutamate-induced down regulation of ATF4. However, oxyquinoline was still able to prevent oxytosis in cells depleted of ATF4. Therefore, the observed regulation of ATF4 protein levels after oxyquinoline application emerged as dispensable for oxyquinoline mediated protection in oxytosis, although previous studies in vivo suggested a modification of ATF4 transcriptional activity as mode of action for oxyquinoline. Overall, the exact mechanism by which PHD inhibition and, in particular oxyquinoline induced neuroprotection in the paradigm of oxytosis remains elusive so far. Finally, PHD inhibition was also shown to protect HT-22 cells against erastin-induced ferroptosis further supporting the pivotal role of PHDs in neuronal demise and the potential of PHD inhibition as a promising therapeutic strategy in the treatment of neurodegenerative diseases, where oxidative stress contributes to progressive mitochondrial dysfunction and neuronal death

Erstellung eines evidenzbasierten Bewertungs- und Informationssystems für OTC-Arzneimittel

Die Selbstmedikation mit Arzneimitteln besitzt einen hohen Stellenwert in Deutschland. Etwa die Hälfte der täglich in Apotheken abgegebenen Medikamente sind rezeptfreie Arzneimittel, welche größtenteils im Rahmen der Selbstmedikation eingesetzt werden. Dabei bietet die Selbstmedikation zahlreiche Chancen und Vorteile für Patienten, Apotheker und die Gesellschaft. In diesem Zusammenhang kommt der Beratung durch den Apotheker eine zentrale Rolle zu, um eine sichere und wirksame Therapie zu gewährleisten. Ferner gewinnt evidenzbasiertes Wissen als Grundlage der Beratung zunehmend an Bedeutung. Im Bereich der Selbstmedikation gibt es jedoch viel ungeprüftes Wissen und im Apothekenalltag fehlt häufig die Zeit, umfangreiche Literaturrecherchen sowie eine evidenzbasierte Bewertung von Over-The-Counter (OTC)-Arzneimitteln durchzuführen. Obwohl ein großer Bedarf besteht, existiert bislang keine geeignete Hilfestellung oder wissenschaftliche Aufarbeitung der Selbstmedikation als Grundlage für eine evidenzbasierte Auswahl von OTC-Arzneimitteln. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Erstellung eines wissenschaftlich fundierten und praxistauglichen Bewertungs- und Informationssystems zur Unterstützung der evidenzbasierten Beratung in der Selbstmedikation. Das System wurde anhand der Indikation Migräne entwickelt, da diese Indikation eine hohe Praxisrelevanz besitzt. Zur Erstellung und Strukturierung des Bewertungssystems wurde der Analytische Hierarchieprozess (AHP) eingesetzt, da mithilfe dieser Methode komplexe Entscheidungsprobleme unterstützt werden können. Das Entscheidungsproblem wurde in einer Hierarchie strukturiert, indem zunächst das übergeordnete Ziel (wirksame und verträgliche Migränetherapie) definiert und anschließend die relevanten Kriterien (Wirksamkeits- und Verträglichkeitsendpunkte) sowie die zur Verfügung stehenden Alternativen (OTC-Wirkstoffe) festgelegt wurden. Die OTC-Wirkstoffe wurden in Bezug auf die einzelnen Kriterien bewertet und unter Beachtung der unterschiedlichen Gewichtung der Kriterien wurde für jeden Wirkstoff ein Gesamtergebnis berechnet. Für die Auswahl und Gewichtung der Kriterien wurden Experten- und Patientensichtweisen berücksichtigt. Zur Bewertung der OTC-Wirkstoffe in Bezug auf die einzelnen Kriterien bzw. Endpunkte wurde ein systematisches, evidenzbasiertes Vorgehen angewandt. Zunächst wurden systematische Literaturrecherchen für die jeweiligen Wirkstoffe durchgeführt. Die Studienauswahl erfolgte entsprechend der vorab festgelegten Ein- und Ausschlusskriterien. Anschließend wurden die Daten der Wirksamkeits- und Verträglichkeitsendpunkte ausgewertet. Um neben der Stärke des Effekts auch die Qualität der Evidenz zu bewerten, wurde zusätzlich das Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation (GRADE)-System eingesetzt. Die Ergebnisse der Auswertungen zu den verschiedenen Wirkstoffen einer Indikation wurden schließlich in transparenten und einfach zugänglichen Summary-of-Findings (SoF)-Tabellen zusammengefasst. Sie bilden die Basis des Informationssystems. Mit dem Bewertungssystem und der Gesamtübersicht einer Indikation werden die Ergebnisse der Beurteilungen der OTC-Wirkstoffe entsprechend der Wirksamkeits- und Verträglichkeitsaspekte übersichtlich dargestellt. Das Bewertungssystem ermöglicht das Abwägen zwischen Vor- und Nachteilen einer Therapie sowie eine vergleichende Einordnung der untersuchten Wirkstoffe. Außerdem kann es flexibel auf verschiedene OTC-Indikationen angepasst werden. Bei der Gewichtung der Wirksamkeits- und Verträglichkeitskriterien können darüber hinaus individuelle Patientenpräferenzen integriert und damit bei der Auswahl des OTC-Wirkstoffs berücksichtigt werden. Somit ist es auch möglich, den Patienten aktiv in den Entscheidungsprozess einzubeziehen. Durch das Informationssystem wird ein hohes Maß an Transparenz erreicht. Mit den SoF-Tabellen der Wirkstoffe werden die zugrundeliegenden Studiendaten in wissenschaftlich aufgearbeiteter Form bereitgestellt. Dadurch wurde eine strukturierte und transparente Darstellung evidenzbasierter Daten und Informationen realisiert, sodass die Ergebnisse der Beurteilungen nachvollziehbar sind. Zum einen bieten die SoF-Tabellen eine schnelle Verfügbarkeit der Datengrundlage, zum anderen können weitergehende Recherchen auf der Basis der jeweils hinterlegten Informationen durchgeführt werden. Zusätzlich wurden Beurteilungen zur Qualität der Evidenz integriert. Dies ist essentiell, um Verzerrungen der Ergebnisse zu verhindern. Die Qualität beschreibt das Vertrauen in den geschätzten Therapieeffekt und bietet dadurch eine wichtige Angabe für die korrekte Interpretation des Effektschätzers bzw. Ergebnisses. Die Angaben zu Effektstärke und Qualität der Evidenz wurden zur leichteren Orientierung mithilfe einer Ampel visualisiert. Anhand der konkreten Ergebnisse für die Indikation Migräne konnte gezeigt werden, dass die untersuchten OTC-Wirkstoffe in dieser Indikation gut wirksam und bei Kurzzeitanwendung im Rahmen der Selbstmedikation gut verträglich sind. Durch die praxistaugliche Bereitstellung der Ergebnisse in Form einer Webanwendung wurde die Anwendbarkeit des Bewertungs- und Informationssystems im Apothekenalltag optimiert. Die webbasierten Umsetzung ermöglicht einen einfachen und schnellen Zugriff für den Einsatz in der täglichen Beratungspraxis. Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein evidenzbasiertes und praxistaugliches Bewertungs- und Informationssystem entwickelt, das erstmals die unterschiedlichen Anforderungen an Übersichtlichkeit und Transparenz vereint. Das erarbeitete System bietet evidenzbasierte Daten sowie transparente und reproduzierbare Ergebnisse der Wirksamkeits- und Verträglichkeitsbewertungen der unterschiedlichen Wirkstoffe, die in der Selbstmedikation akuter Migränekopfschmerzen eingesetzt werden. Durch die Ergänzung weiterer Indikationen kann der Einsatz als Webanwendung eine sinnvolle Unterstützung bei der evidenzbasierten Beratung zu OTC-Arzneimitteln in der Apotheke bieten. Mithilfe des Bewertungs- und Informationssystems wird es deutlich einfacher möglich sein, evidenzbasiertes Wissen mit der klinischen Expertise des Apothekers und individuellen Patientenpräferenzen zu kombinieren und in den Beratungsalltag zu integrieren

Untersuchung des Einflusses einer Medikationsanalyse auf die Therapie von Patienten mit Typ-2-Diabetes in öffentlichen Apotheken in Deutschland (DIATHEM-Studie)

Patienten mit Typ-2-Diabetes im geriatrischen Alter sind chronisch kranke Patienten, häufig zusätzlich belastet durch Multimorbidität und Polymedikation. Studien aus anderen Ländern zeigen, dass Typ-2-Diabetiker von einer interprofessionellen Medikationsanalyse profitieren können und diese Intervention die Arzneimitteltherapiesicherheit (AMTS) erhöht. Obwohl seit 2012 als pharmazeutische Tätigkeit in der Apothekenbetriebsordnung verankert, sind Medikationsanalyse und Medikationsmanagement in öffentlichen Apotheken in Deutschland noch nicht flächendeckend implementiert. Ziel der DIATHEM-Studie (DIAbetes Mellitus Typ 2: THErapieoptimierung durch Medikationsanalyse) war die Untersuchung des Einflusses von Medikationsanalysen unter Alltagsbedingungen in öffentlichen Apotheken in Deutschland auf die Therapie von Patienten mit Typ-2-Diabetes im geriatrischen Alter mit Polymedikation. Primäre Studienziele waren die Identifizierung von Anzahl und Art der arzneimittelbezogenen Probleme (ABP) in der Medikation zu Beginn der Medikationsanalyse sowie die Evaluation der Anzahl der ABP, die durch die Intervention Medikationsanalyse vollständig, teilweise oder gar nicht gelöst werden konnten. Sekundäre Ziele waren die Evaluation von Arzneimittelinteraktionen sowie Anzahl und Art der eingesetzten Wirkstoffe zu Beginn der Medikationsanalyse und die Evaluation von Änderungen in der Anzahl der Wirkstoffe durch die Intervention Medikationsanalyse. Außerdem wurde die interprofessionelle Zusammenarbeit zwischen Apothekern und Ärzten im Rahmen der Medikationsanalysen untersucht. In dieser einarmigen prospektiven Interventionsstudie wurden für Typ-2-Diabetiker, die dauerhaft mit mindestens fünf Arzneistoffen behandelt wurden und mindestens 65 Jahre alt waren, von 13 öffentlichen Apotheken im Raum München im Zeitraum Februar 2016 bis April 2017 Medikationsanalysen Typ 2a oder 2b durchgeführt. Identifizierte ABP wurden anhand der PCNE (Pharmaceutical Care Network Europe) Klassifikation arzneimittelbezogener Probleme V9.0 und einer ABP-Einteilung der Bundesvereinigung Deutscher Apothekerverbände e. V. (ABDA) kategorisiert. Die Ärzte wurden im Vorfeld nicht über die Medikationsanalysen informiert. Weder die beteiligten Apotheker, Ärzte noch Patienten erhielten eine finanzielle Entschädigung für die Mitwirkung an der Studie. Für insgesamt 121 Patienten wurden 586 ABP identifiziert (4,84 ABP pro Patient; Standardabweichung (SD) = 2,7), wovon 31,6% Diabetes-bezogen waren. Durch die Intervention Medikationsanalyse wurden 46,9% aller ABP vollständig gelöst, was einer statistisch signifikanten Reduktion um 2,27 ABP (SD = 2,3) pro Patient (p < 0,001) entspricht. Die durchschnittliche Wirkstoffanzahl wurde statistisch signifikant von 9,5 (SD = 2,9) auf 9,3 Wirkstoffe (SD = 2,8) pro Patient reduziert (p = 0,001). Eine generelle Rückmeldung der Ärzte auf die pharmazeutischen Interventionsvorschläge erfolgte zu 76,7% und die Kooperationsbereitschaft lag bei 64,0%. Insgesamt wurden 59,5% der Interventionsvorschläge akzeptiert, davon 85,3% akzeptiert und vollständig umgesetzt. Zusammenfassend zeigt die DIATHEM-Studie, dass systematische Medikationsanalysen durch öffentliche Apotheken unter Alltagsbedingungen ABP in der Medikation von multimorbiden, geriatrischen Typ-2-Diabetikern erfolgreich identifizieren und lösen können. Einige Rahmenbedingungen wie adäquate Honorierung und interdisziplinäre Zusammenarbeit müssen verbessert werden, damit diese pharmazeutische Dienstleistung in Deutschland flächendeckend implementiert werden kann. Dies würde den Patienten, dem Apothekerberuf und dem Gesundheitssystem gleichermaßen einen hohen Nutzen bringen

Targeting Bid for mitoprotection - Bid crystallization, new mechanisms and inhibitory compounds

Mitochondriale Prozesse des Zelltods spielen eine entscheidende Rolle für den progressiven Verlust von Neuronen bei neurodegenerativen Erkrankungen (M. Alzheimer, M. Parkinson) und nach akuter Hirnschädigung durch Schädel-Hirn-Trauma oder zerebraler Ischämie. Eine Schlüsselfunktion nimmt hierbei das pro-apoptotische Bcl-2 Protein Bid ein. Durch die Aktivierung und mitochondriale Translokation von Bid kommt es zur Schädigung und Fragmentierung von Mitochondrien und letztlich zur Freisetzung von weiteren pro-apoptotischen Faktoren (AIF, Cytochrom C, Smac/DIABLO), die den Untergang der Neurone steuern. Um in Zukunft Bid als potentielles Target für die Therapie von akuten und chronischen neurologischen sowie nicht neurologischen Erkrankungen nutzen zu können, müssen die bisher ungeklärten Mechanismen der Bid-induzierten mitochondrialen Schädigung, sowie die Interaktionen von aktiviertem Bid mit weiteren am Zelltod beteiligten Proteine aufgeklärt werden. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung Bid-abhängiger, mitochondrialer Zelltod Mechanismen und beteiligter Protein-Wechselwirkungen. Darüber hinaus stand die Entwicklung neuer Leitstrukturen für protektive Bid-Inhibitoren sowie die Etablierung erster Kristallisationsansätze verschiedener Bid Konstrukte im Fokus dieser Arbeit. Als Modellsyteme mitochondrialer Prozesse des Zelltods dienten vor allem immortalisierte hippokampale Neurone (HT-22 Zellen), in denen eine Behandlung mit Glutamat den durch oxidativen Stress gekennzeichneten Zelltod induziert. Als weiteres Schädigungsmodell wurde die Überexpression von aktiviertem Bid (tBid) eingesetzt. Zum Nachweis von Proteininteraktionen wurden weiterhin eine primäre neuronale Zellkultur und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie verwendet, sowie verschiedene Untersuchung mit rekombinanten Proteinen durchgeführt. Neue niedermolekulare Bid-Inhibitoren aus drei strukturell verschiedenen Substanzklassen wurden mittels Zellviabilitätsmessungen auf neuroprotektive Effekte geprüft. Sieben Substanzen zeigten nicht nur deutliche Protektion gegenüber dem Glutamat- und tBid-induzierten Zelltod, sondern konnten ebenso die Bid-abhängige mitochondriale Schädigung verhindern. Weiterhin bietet die Arbeit Einblicke in die Kristallisation von rekombinantem Bid Protein, welche als Basis für ein grundlegendes Verständnis der molekularen Proteinfunktion sowie der Struktur-basierten Wirkstoffentwicklung dient. Durch Verfolgung wichtiger Strategien im Konstruktdesign konnte eines der verwendeten Bid Konstrukte erfolgreich kristallisiert werden und lieferte eine Strukturauflösung von 3.75 bis 3.95 Ǻ unter Synchrotronstrahlung. Weiterhin wurde der Effekt der rekombinanten Proteine Bid, cBid und Bax auf Fluoreszenz-Liposomen getestet, um die Mechanismen der Bid-abhängigen mitochondrialen Membranpermeabilisierung zu untersuchen. Es konnte hier eine Schlüsselrolle für das mitochondriale Lipid Cardiolipin gezeigt werden, in dessen Abhängigkeit Caspase-8 aktiviertes Bid (cBid) eine Membrandestabilisierung vermittelte, welche durch die Koexistenz von Bax gesteigert werden konnte. Letztlich konnte erstmals eine direkte Interaktion zwischen Bid und dem mitochondrialen Porin VDAC1 in kultivierten Neuronen sowie in einem in vivo Modell der zerebralen Ischämie nachweisen. Die Inhibition von VDAC1 mittels Einsatz des Anionen-Kanal-Blockers DIDS sowie der Verwendung von VDAC1 siRNA konnte sowohl die Funktion als auch die Integrität der Mitochondrien nach Glutamat- und tBid-induzierter Schädigung schützen und bestätigte somit die essentielle Rolle von VDAC1 im Bid-abhängigen Zelltod. Weitere Untersuchungen zeigten erstmalig, dass beide Proteine, Bid und VDAC1, gleichermaßen im neuronalen Zelltod involviert sind und offensichtlich zusammen eine Schädigung der mitochondrialen Membran induzieren. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Isoform VDAC2 nur eine untergeordnete Rolle im Bid-induzierten Zelltod in Neuronen spielt. Die nachgewiesene Bid-VDAC1 Wechselwirkung besitzt hohe Relevanz für die mitochondrialen Prozesse des Zelltods. Damit verbindet die vorliegende Arbeit die bisher kontrovers betrachten Mechanismen der mitochodrialen Membranschädigung, die zuvor entweder auf die alleinige Aktivität der Bcl-2 Proteine oder auf VDACs zurückgeführt wurde. Mit der Identifizierung neuer potentieller Bid-Inhibitoren sowie durch Etablierung wichtiger Grundlagen für die Aufklärung der Kristallstruktur von Bid, stellt die Arbeit einen wesentlichen Beitrat für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung und Therapie verschiedener neurologischer und nicht neurologischer Erkrankungen dar, in welchen Bid-abhängige mitochondriale Prozesse des Zelltods eine wesentliche Rolle spielen

The role of 12/15-lipoxygenases in ROS-mediated neuronal cell death

Oxidative stress has been established as a key trigger of neuronal dysfunction and death in age-related neurodegenerative diseases and in delayed neuronal death after acute brain injury by ischemic stroke or brain trauma. Despite increasing knowledge on the toxicity of reactive oxygen species (ROS) and oxidized reaction products that may further accelerate neuronal cell death, the major sources of ROS formation and the mechanisms involved in cell death signaling triggered by oxidative stress in neurons are poorly defined. Therefore, major aims of this study included the characterization of key enzymes that contribute to the formation of ROS and key factors of the downstream signaling pathways that may amplify the oxidative cellular stress thereby causing irreversible damage and death in neurons. Major parts of the study were performed in a model of glutamate toxicity in immortalized hippocampal HT-22 neurons, since glutamate selectively induced oxidative stress through glutathione depletion in these cells. To verify the relevance of the findings in HT-22 cells for post-mitotic neurons, further experiments included models of glutamate-induced excitotoxicity and oxygen-glucose deprivation primary embryonic neurons in vitro and in a mouse model of cerebral ischemia in vivo. The findings of these studies revealed that 12/15-lipoxygenases (LOX), but neither 5-LOX nor COX activation, mediated glutamate-induced lipid peroxidation and oxidative cellular death (oxytosis) in HT-22 cells. Pharmacological inhibition of 12/15-LOX protected HT-22 cells as well as primary neurons against glutamate toxicity. This protective effect included significantly reduced ROS formation and attenuated deregulation of the intracellular calcium homeostasis in the cultured neurons. Moreover, the 12/15 LOX inhibitor PD146176 reduced neuronal cell death after OGD in primary neurons in vitro, and significantly reduced the infarct volume after MCAO in vivo. Further experiments addressing the involved signaling pathways linked, for the first time, 12/15-LOX activation and key mediators of mitochondrial death pathways. In particular, the selective 12/15-LOX inhibitor PD146176 reduced mitochondrial fragmentation and ATP depletion after exposure to glutamate in HT-22 cells. Most interestingly, this study identified the pro-apoptotic Bcl-2 protein Bid as a key link between 12/15-LOX activation, mitochondrial demise and the translocation of the mitochondrial protein AIF to the nucleus. In fact, mitochondrial transactivation of Bid downstream of 12/15-LOX activation was exposed as the key step for the mitochondrial damage that resulted in a second burst of lipid peroxidation and marked the ‘point of no return’ in the glutamate-induced death cascade. In summary, the glutamate-induced cell death mechanisms in HT-22 cells are highly relevant for neurodegenerative diseases and acute neurological disorders. Thus, 12/15-LOX is proposed as a potential therapeutic target for neuroprotective strategies in neurological disorders

Die Implementierung von Objective Structured Clinical Examinations (OSCEs) im Fach „Klinische Pharmazie“ – Eine Studie zur praxis- und kompetenzorientierten Lehre und Prüfung

Das Berufsbild des Apothekers hat in den letzten Jahrzehnten einen starken Wandel erfahren: Über die Arzneimittelversorgung hinaus, leisten Apotheker in den öffentlichen Apotheken und in den Krankenhäusern einen wesentlichen Beitrag zur Arzneimitteltherapiesicherheit (AMTS) und zur Therapieoptimierung ihrer Patienten. Der Patient rückt in den Mittelpunkt einer multiprofessionellen Behandlung. Das Medikationsmanagement, die Arzneimitteltherapiesicherheit und die interprofessionelle Zusammenarbeit nehmen im ambulanten sowie im stationären Versorgungsektor an Bedeutung zu. Die Anforderungen an die Apotheker sind entsprechend gestiegen. Folglich sollten auch die Lehr- und Prüfungsformate der pharmazeutischen Ausbildung in Deutschland entsprechend überarbeitet werden, damit die Kompetenzen der Examinierten den aktuellen Entwicklungen in der pharmazeutischen Berufswelt gerecht werden. Objective Structured Clinical Examinations (OSCEs) stellen ein geeignetes Lehr- und Prüfungsformat dar, um klinische Kompetenzen und professionellen Verhalten sowie das klinisch-pharmazeutische Fachwissen, die Fähigkeit zur Problemlösung, Kommunikations- und Beratungskompetenzen der Studierenden zu überprüfen. OSCEs sind eine Prüfungsmethode, in der der Prüfling durch einen Parcours zeitbegrenzter Stationen rotiert und bezüglich seiner professionellen Leistung in einer simulierten, kontrollierten Umgebung mittels eines standardisierten Punktesystems geprüft wird. International haben sich OSCEs in der medizinischen Lehre und Prüfung sowie in der Pharmazie und Krankenpflege bereits als reliables und valides Prüfungsformat erwiesen. An den deutschen Universitäten hingegen gibt es immer noch Handlungsbedarf bezüglich praxis- und kompetenzorientierter Lehr- und Prüfungsmethoden. Bisher beschreiben einige wenige Berichte den Einsatz von OSCEs in der Pharmazie in Deutschland. Mit diesem Projekt sollte somit die wissenschaftliche Basis für die Implementierung einer validen, reliablen und praktikablen, sowie an den aktuellen Wandel der pharmazeutischen Wissenschaften und Lehrinhalte angepassten Prüfungsform geschaffen werden. Die Reliabilität (Zuverlässigkeit) der durchgeführten OSCEs wurde mittels Cronbachs Alpha bestimmt. Zur Qualitätssicherung der OSCEs wurde die Berechnung eines theoretischen Wertes für Cronbachs Alpha durchgeführt, wenn einzelne OSCE-Stationen weggelassen werden würden. Des Weiteren wurden die korrigierten Trennschärfen der einzelnen OSCE-Stationen untersucht, um Aussagen darüber treffen zu können, ob die OSCE-Stationen in der Lage sind, zwischen „guten“ von „weniger guten“ Studierenden zu differenzieren. Die minimal und maximal erreichten, relativen Punktzahlen und die relativen Mittelwerte – die normierten Aufgabenschwierigkeiten – der einzelnen OSCE-Stationen sowie des Gesamt-OSCEs wurden errechnet. Die Validität (Gültigkeit) wurde anhand der Korrelation der in den OSCEs erreichten Punktzahl mit der erreichten Punktzahl der ersten Abschlussklausur und mit der Note des Zweiten Staatsexamens im Fach Klinische Pharmazie mittels Spearman-Rho ermittelt. Zur Beurteilung der Praktikabilität wurden der Zeit-, Raum- und Personalbedarf für jedes Semester erhoben und die möglichen entstehenden Kosten für ein 10-Stationen-OSCE für 100 Studierende als Gesamtbetrag sowie als Betrag an Aufwendungen pro Prüfling errechnet. Das Projekt wurde im Fach Klinische Pharmazie der Philipps-Universität Marburg durchgeführt. Das Pilotprojekt beschäftigte sich dabei vor allem mit der Entwicklung eines geeigneten OSCE-Konzeptes. Verschiedene OSCE-Settings wurden getestet, um zu ermitteln, zu welchem Zeitpunkt im Curriculum OSCEs am besten geeignet sind, wie viele Stationen ein reliables, aber zugleich praktikables OSCE haben sollte und welchen Mehrwert ein extracurricularer, vorbereitender Kurstag hat. Im Hauptprojekt wurde dieses Konzept auf Studierendenkohorten in Semestergröße übertragen. Die durchgeführten OSCEs zeigten eine moderate bis hohe Reliabilität, vergleichbar mit internationalen und nationalen OSCEs der Inneren Medizin. Die OSCEs wiesen eine angemessene Aufgabenschwierigkeit für Pharmaziestudierende des 8. Fachsemesters im Fach Klinische Pharmazie auf und sind in der Lage, zwischen „guten“ und „weniger guten“ Studierenden zu differenzieren. Eine moderate Korrelation bestand mit der Abschlussklausur im Fach Klinische Pharmazie, keine Korrelation mit den Ergebnissen im Zweiten Staatsexamen in diesem Fach. Nach Millers Pyramide der Kompetenzentwicklung prüfen OSCEs Kompetenzen höherer Stufen, die mit Multiple-Choice-Fragen und offenen Fragen nicht erfasst werden können. Daraus lässt sich schließen, dass eine Kombination aus vorrangig auf Fachwissen basierenden Prüfungsformaten mit kompetenzbasierten, praxisorientierten Prüfungsmethoden wie OSCEs eine umfassendere Beurteilung der Studierenden sowie eine Evaluierung ihrer klinischen Kompetenzen und des professionellen Handelns erlaubt. Die erfolgreiche Durchführung stellt sich als verhältnismäßig zeit- und personalintensiv dar. Für die Umsetzung werden geeignete Räumlichkeiten sowie eine ausreichende Anzahl an Mitarbeitern benötigt. Die Vorbereitung und Planung setzt ein hohes Maß an Struktur und Organisation voraus, um einen problemlosen Ablauf des zeitlich exakt getakteten OSCE-Parcours am Prüfungstag zu ermöglichen. Mit diesem Projekt konnte gezeigt werden, dass OSCEs eine reliable und valide Lehr- und Prüfungsform darstellen und auch in der Pharmazie für Studierendenkohorten in Semestergröße von rund 100 Studierenden etabliert werden können

Targeting mitochondria: Novel concepts for mechanisms underlying therapeutic effects of Cimicifuga racemosa and Petasites hybridus extracts

The Cimicifuga racemosa extract Ze 450 is produced by a standardized procedure and well-established in the treatment of menopausal complaints; however, the underlying mechanism of action has not been clarified. In a recent study, Ze 450 mediated beneficial effects on glucose tolerance, insulin sensitivity and weight gain in diabetic ob/ob mice and on weight gain in a clinical study investigating therapeutic effects of Ze 450 on climacteric symptoms in menopausal women. Therefore, it was of great interest to study the effects of Ze 450 on cell metabolism in more detail. To address this issue, Ze 450 was exposed to neuronal and liver cells alone, and in model systems of oxidative stress, since an imbalance in redox homeostasis was shown to be crucially involved in the pathogenesis of many age-related diseases, including, for example, diabetes mellitus type II, and further provides a molecular link towards menopause. In this context, a new concept of menopause is hypothesized, implying age-related metabolic disturbances rather than exclusively focusing on estrogen depletion. This study revealed that Ze 450 mediated remarkable effects on metabolism by reducing metabolic activity and the rate of cell proliferation in various cell types. Furthermore, it was demonstrated that Ze 450 provided protection against erastin- and glutamate-mediated oxidative cytotoxicity in neuronal and liver cells. Notably, the findings on liver cells clearly demonstrated, that Ze 450 is rather protective than causing hepatotoxicity. Additionally, Ze 450 preserved mitochondrial integrity and function, while under oxidative challenge, Ze 450 prevented mitochondrial impairments by protecting against erastin- and glutamate-mediated lipid-peroxidation, mitochondrial ROS formation, loss of mitochondrial membrane potential and ATP depletion. Ze 450 exerted beneficial effects by directly inhibiting mitochondrial respiration and, thereby, reducing mitochondrial superoxide production. Moreover, Ze 450 preserved the energy supply of the cell by metabolic reprogramming towards glycolysis. In this context, it was demonstrated that a regulation of HIF1α and cMyc most likely contributed to the metabolic shift by enhancing the protein expression of key glycolytic enzymes. Further, it was demonstrated that Ze 450 enhanced glucose uptake to maintain cellular energy homeostasis by promoting glycolysis. These results demonstrated that Ze 450 affects energy metabolism by direct inhibition of mitochondrial respiration and metabolic reprogramming towards glycolysis, supporting a novel therapeutic concept describing Ze 450 as a metabolic regulator. Ze 450 is a plant extract, which consists of many different components. In former studies, triterpene glycosides were identified as active ingredients, but in neuronal cells, the isolated components (actein, 23-epi-26-deoxyactein, cimiracemoside C) were not able to mediate effects comparable to Ze 450. Nevertheless, sub-fractions of Ze 450 were investigated and the EtOAc fraction turned out to act in a similar manner like Ze 450, but the effective concentrations were higher than contained in 100 µg/mL of Ze 450. Besides triterpene glycosides, Ze 450 also contains phenolic acids that mediate antioxidant effects. Indeed, Ze 450 showed moderate antioxidant properties compared to Trolox but this antioxidant effect is not mainly contributing to the observed protection by Ze 450. Taken together, Ze 450 offers promising therapeutic potential in diseases involving mitochondrial damage and increased ROS formation and provides first evidence for a novel mechanism of action involving metabolic reprogramming, which highlights a new perspective on menopausal transition. Besides Ze 450, a special extract of Petasites hybridus was investigated in the model systems of ferroptosis. Ze 339 is a CO2 extract obtained from leaves of Petasites hybridus and is used to treat seasonal allergic rhinitis. In this study, Ze 339 was investigated in order to specify its mechanism of action and assess its potential protective effects against oxidative damage in HT22 neuronal cells. Ze 339 induced mild ROS formation produced by lipid-peroxidation and by mitochondria but did not impair cell viability at concentrations up to 50 µg/mL of Ze 339. In the context of mitohormesis, Ze 339 might provide protection against mitochondrial impairment by a mild increase in ROS. Moreover, Ze 339 protected against erastin- mediated cytotoxicity and mitochondrial impairment in HT22 neuronal cells. In conclusion, it is hypothesized that Ze 339 provides mitochondrial resilience by a mild increase in ROS formation leading to beneficial metabolic adaptions or responses to allergens. In this study, it was demonstrated that (mito-) hormetic regulation processes might contribute to symptom relief of allergic rhinitis

Cyclophilin A and serine proteases : Targets of neuronal cell death upstream of mitochondrial demise

Many neurological disorders and neurodegenerative diseases are associated with mitochondrial abnormalities. Mitochondria are essential organelles regulating the energy metabolism of the cell, thereby, determining essential cellular functions and viability. This accounts particularly for neurons which show a pronounced energy demand and where mitochondria play a pivotal role in balancing the Ca2+ homeostasis, controlling ROS formation and providing most of the energy for neurotransmitter metabolism and maintenance of the membrane potential. Further, mitochondria are essential organelles controlling the ‘point of no return’ in intrinsic pathways of programmed cell death where the decision between cellular life and death involves post-translational protein modifications determining mitochondrial dysfunction and release of detrimental proteins such as AIF. Therefore, major aims of the present thesis included the characterization of the key regulators of protein modifications that occur upstream of mitochondrial demise and AIF release. In this context, the role of two PPIases, CypA and Pin1, and the involvement of serine proteases in paradigms of PCD were investigated. Most experiments were performed in an immortalized neuronal cell line (HT22 cells) which depicts a well-established model to study caspase-independent cell death induced by glutamate. The most prominent feature in this model of cell death is the mitochondrial AIF release and the subsequent translocation to the nucleus where it induces chromatinolysis. To substantiate the importance of these results further experiments were performed in a model of glutamate-induced excitotoxicity in primary cortical neurons. The findings of the first part of this study revealed a prominent role for CypA in glutamate-induced mitochondrial AIF release and cell death. Glutamate toxicity resulted in the translocation of CypA to the nucleus where it built a pro-apoptotic complex with AIF, thereby inducing chromatinolysis. Silencing of CypA protected HT22 cells against glutamate toxicity. Moreover, the depletion of CypA preserved mitochondrial fission and the loss of MMP and also prevented the release of AIF from the mitochondria. Furthermore, lipid peroxidation arising from the mitochondria was attenuated which supported increased cell viability. Further experiments addressed the involvement of a second family member of PPIases, Pin1, in neuronal cell death pathways. The inhibition of Pin1 with Br57 resulted in decreased susceptibility of HT22 cells to glutamate toxicity. This increase in cell viability was attended by changes at the level of mitochondria. Pin1 inhibition led to enhanced mitochondrial fission, but further, complete mitochondrial fragmentation induced by glutamate was attenuated. This elevated mitochondrial fission rate was accompanied by a slight decrease in ATP levels in Br57-treated controls, however, the strong ATP depletion that occurred after the glutamate challenge was prevented and the impairment of MMP was abolished. In summary, these findings depict a pivotal role for CypA and Pin1 in glutamate-induced cell death in HT22 cells upstream of mitochondrial demise. Since this model exhibits common features of neurological disorders the results obtained here may give a platform to investigate new neuroprotective strategies. The second part of this thesis dealt with the impact of activated trypsin-like serine proteases on cell viability and mitochondrial function. Inhibition of serine proteases with TLCK resulted in increased cell viability in HT22 cells and in primary cortical neurons. Furthermore, this work revealed that activation of trypsin-like serine proteases occurred upstream of Bid activation and moreover, in a very initial phase of this PCD pathway in HT22 cells. Further, lipid peroxidation was blocked and mitochondrial morphology alterations were prevented. In addition, ATP depletion and the impairment of the MMP were preserved and the decrease in mitochondrial respiration after glutamate toxicity was abolished. Interestingly, the interaction of Drp1 and CypA was strengthened by TLCK. However, the release of Drp1 from the actin cytoskeleton and the following redistribution of Drp1 from the cytoplasm to the mitochondria were not prevented. In conclusion, the second part of this thesis highlighted trypsin-like serine proteases as mediators of glutamate-induced cell death in HT22 cells. The initial activation in this PCD pathway is a promising target for therapeutic intervention strategies in neurological diseases

Molecular regulation of mitochondrial dynamics by dynamin-related protein 1 (Drp1) and Bid in model systems of neuronal cell death

Mitochondrien sind Schlüsselorganelle in Signalwegen der neuronalen Apoptose und in Entwicklungs- und Alterungsprozessen der Zelle. Mitochondrien sind hoch dynamische Organelle, welche sich abhängig der physiologischen Bedingungen als lange miteinander verbundene Netzwerke oder als kleine, runde Organelle darstellen. Unter pathologischen Bedingungen und im neuronalen Zelltod ist die Regulation der Mitochondrienmorphologie deutlich verändert, wobei das Gleichgewicht der mitochondrialen Dynamik in Richtung Fragmentierung verschoben wird. Entsprechende Veränderungen der Mitochondrien treten z. B. im verzögerten neuronalen Zelltod nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma auf und vermehrt fragmentierte Mitochondrien sind auch in geschädigtem Hirngewebe bei alters-bedingten neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson nachgewiesen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vor allem eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) verwendet, um die Regulation und die Bedeutung der vermehrten Mitochondrienfragmentierung im oxidativen neuronalen Zelltod zu untersuchen. In diesen Zellen führt eine Behandlung mit Glutamat zu einem kontinuierlichen Abfall der intrazellulären Glutathionspiegel und induziert somit oxidativen Stress. Zusätzlich wurden primäre neuronale Zellkulturen und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie eingesetzt, um die in HT-22 Zellen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen und auszubauen. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, ob verstärkte mitochondriale Fragmentierung den Glutamat-induzierten Zelltod begleitet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Glutamat-induzierte Apoptose mit einer verstärkten Fragmentierung von Mitochondrien, dem Verlust von mitochondrialen Membranpotential und einer Umverteilung von fragmentierten Mitochondrien um den Zellkern verbunden ist. Weiter zeigen die hier dargestellten Ergebnisse eine Schlüsselrolle für das BH3-Protein Bid in der mitochondrialen Fragmentierung auf, die durch den oxidativen Stress ausgelöst wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die Rolle des Dynamin Proteins Drp1 im neuronalen Zelltod nach Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen und in primären kortikalen Neuronen. Um die Rolle von Drp1 im Glutamat-induzierten Zelltod nachzuweisen, wurde in dem hier angewendeten Modellsystem des oxidativen Stress zum ersten Mal hoch spezifische Drp1 Inhibitoren und Drp1 siRNA angewendet. Die Deletion von Drp1 durch siRNA oder durch den Drp1 Inhibitor zeigen, das mitochondriale Membranpotential aufrechterhalten werden kann und die mitochondriale Fragmentierung in HT-22 Zellen, als auch in primären Neuronen verhindert werden. Der Drp1 Inhibitor blockierte zudem den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff-Glukose-Entzug in primären Neuronen und verringert auch signifikant das Infarktvolumen in einem Schlaganfallmodell in Mäusen. Diese Daten heben Drp1 als einen Schlüsselfaktor bei ischämisch- und Glutamat-induziertem neuronalen Zelltod hervor und identifizierten Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung als eine mögliche therapeutischen Zielstruktur für die Therapie von akuten zerebrovaskulären Erkrankungen. Weitere Untersuchungen zu einer möglichen Wechselwirkung zwischen Bid und Drp1 im neuronalen Zelltod zeigten zudem erstmalig, dass offenbar beide Proteine nach oxidativem Stress zusammen an der Mitochondrienmembran agieren, um intrinsische Signalkaskaden der Apoptose zu induzieren. Die Hemmung eines der Proteine war ausreichend, um die mitochondriale Translokation bzw. die toxischen Effekte des Partners an den Mitochondrien zu hemmen und so den neuronalen Zelltod zu verhindern. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bid und Drp1 zusammen als Schlüsselregulatoren des mitochondrialen neuronalen Zelltodes in HT-22 Zellen agieren und das die Hemmung von Drp1 auch in primären Neuronen, und auch in einem Schlaganfallmodell in Mäusen eine protektive Wirkung vermittelt. Der Bid-vermittelte neuronale Zelltod umfasst Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung, mitochondriale Umverteilung um den Zellkern, mitochondriale Membranschädigung und die Freisetzung von mitochondrialen Apoptose-Mediatoren wie AIF. Aus diesem Grund sind Bid und Drp1 vielversprechende therapeutische Zielstrukturen, die durch neuartige Inhibitor-Moleküle blockiert werden können, um mitochondriale Fragmentierung und Dysfunktion, als Kennzeichen des neuronalen Zelltodes bei akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen zu verhindern, in denen Glutamatschädigung bzw. oxidativer Stress zu den wesentlichen auslösenden Faktoren für die Nervenschädigung führen

The role of p53 and CYLD in mitochondrial death pathways and mechanisms of neuronal necroptosis

Neuronal cell death causes progressive loss of brain tissue and function after acute brain injury and in chronic neurodegenerative diseases. Although the pathological features of stroke and brain trauma or Alzheimer’s and Parkinson’s disease differ greatly, the underlying neuronal damage shares common molecular and cellular mechanisms. Despite extensive research and increasing knowledge on the molecular pathology, no efficient therapy has been born from these efforts until today. As a promising concept to overcome this plight, it has been suggested to enhance endogenous survival signaling pathways like the transcription factor NF-κB and thus obtain neuroprotection. Increasing neuroprotective NF-κB signaling can be achieved by blocking repressors of NF-κB transcriptional activity such as p53 and CYLD. Both factors may mediate cell death by mechanisms dependent on and independent of NF-ΚB signaling. Therefore, the major aim of this study was to explore the roles of p53 and CYLD in neuronal cell death and to connect their detrimental effects with NF-κB activity. This issue was addressed in immortalized mouse hippocampal HT-22 neurons and in primary neuronal cultures exposed to glutamate toxicity. Furthermore, an in vivo model system of traumatic brain injury was employed to compare infarct development after controlled cortical impact in wild-type and CYLD-/- mice. The present study revealed that both approaches, inhibiting p53 and CYLD successfully preserved mitochondrial integrity and function, and significantly attenuated neuronal cell death. Surprisingly, however, the pronounced neuroprotective effect of the p53-inhibitor pifithrin-α occurred independently of enhanced NF-κB activity in HT-22 cells. In addition, neuroprotection induced by silencing of CYLD was completely independent of NF-κB, despite of the previously established role of CYLD as a negative regulator of NF-κB in keratinocytes. In line with that notion, the NF-κB subunit expression and NF-κB transcriptional activity were not significantly altered in HT-22 neurons undergoing glutamate dependent cell death. In conclusion, these data suggested that the NF-κB pathway was neither significantly affected by glutamate dependent cell death, nor did it mediate the neuroprotective response of CYLD and p53 inhibition in this model system of glutamate toxicity. Interestingly, inhibiting p53 with pifithrin-α maintained mitochondrial morphology and mitochondrial membrane potential in HT-22 cells. This effect occurred independently of p53 dependent transcription. Investigating the underlying cause of neuroprotection associated with CYLD depletion, it was unveiled that glutamate-induced oxytosis in HT-22 cells occurred through mechanisms of necroptosis. This conclusion is based on the detection of RIP1/RIP3 complexes as a hallmark of necroptotic cell death in HT-22 cells exposed to glutamate. Further, silencing either RIP-kinase provided strong protection of the cells. Repressing CYLD, in turn, prevented the formation of the RIP1/RIP3 necrosome, suggesting that inhibition of necroptosis was the underlying mechanism of neuroprotection after CYLD depletion. In contrast, CYLD depletion had no effect on cell death in a model of glutamate excitotoxicity in primary cultured neurons, while inhibition of RIP1 kinase by necrostatin-1 significantly enhanced neuronal survival. These data suggest a CYLD independent but RIP1 dependent mechanism of glutamate toxicity in primary neurons, which requires further investigation. In vivo, however, using a model of traumatic brain injury, CYLD knockout mice showed a significantly reduced infarct size compared to wild-type littermates suggesting a potent neuroprotective effect inherent with CYLD repression. In summary the data from this thesis highlight a yet unknown role of CYLD in neuronal cell death and unravel CYLD and p53-dependent mechanisms of cell death as a putative therapeutic approach for the treatment of acute and chronic neurodegenerative diseases. Future research, however, is warranted to further elucidate the exact mechanisms leading to CYLD and RIP-kinase activation in neurons and to determine the exact molecular link to mitochondria