Les cellules non lymphoïdes du thymus murin in vitro : iconographie

L’introduction bibliographique, nous a permis de revoir les fonctions du thymus et de résumer les propriétés des différents compasnats du microenvironnement thymlique. Celui-ci dépend de cellules épithéliales corticales et médullaires, de macrophages, de cellules interdigitées, de cellules endothéliales et de cellules conjonctives. Le rôle respectif des cellules non lymphoïdes est peu connu en raison de la compléxité de structure de l’organe et parce que leurs caractéristiques ne sont pas clairement définies. On ne dévoilera leurs modes d’action que par des études « in vitro » sélectionnant rigoureusement chaque type cellulaire. Dans la partie consécrée aux matériels et méthodes, nous décrivons les techniques d’isolement cellulaire, de cultures, de microscopie optique et électronique, de marquages immunocytochimiques et de greffes, requises pour caractériser les cellules non lymphoïdes. Les résultats personnels sont décrits dans deux chapitres : le premier est consacré à l’isolement enzymatique des différentes cellules thymiques et à la sélection de cellules « nurses » ; le deuxième est consacré à l’étude des cellules non lymphoïdes, an particulier celle des cellules épithéliales en culture organotypique et en monocouches dérivées de cellules nurses. Le premier chapitre nous a permis de décrire les complexes multicellulaires formés d’une cellule non lymphoïde associée étroitement à quelques thymocytes : les rosettes et les nurses. Leur description « in vivo » et au cours d’un isolement progressif démontre que leur existence « in situ »et que leur aspect « in vitro » dépend de la disposition de leurs prolongements. Les cellules étoilées corticales et médullaires et les cellules globuleuses deviennent nurses lorsqu’elles sont isolées. La plupart cependant proviennent du cortex et sont formées d’une ou de plusieurs cellules épithéliales. La petitesse des mailles du réseau épithélial cortical périphérique associée à la densité élevée des cellules épithéliales expliquent pourquoi les cellules nurses se forment plus aisément à partir de cette région. Sous l’effet de la trypsine, les desmosomes sont rompus et les prolongements des thymocytes généralement isolés du milieu extérieur. L’aspect des cellules nurses n’est pas propre aux cellules épithéliales. Certains macrophages englobent des thymocytes intacts et ressemblent aux nurses épithéliales. Contrairement à celles-ci, ils existent tels quels ‘in vivo » dans le cortex profond car les thymocytes qu’ils contiennent ne sont pas entourés de rouge de ruthénium, mélangé au fixateur. Dans tout le cortex, d’autres macrophages plus nombreux ont une forme réticulaire qui rappelle celle des cellules étoilées. Leurs contacts avec les thymocytes sont nombreux et étroits. Ils se présentent sous forme de petites expansions logées dans de petites dépressions cytoplasmiques du macrophage. Elles correspondent à celles déjà décrites entre les cellules épithéliales et thymocytes corticaux. Ces contacts ont été fréquemment observés entre macrophages et cellules blastiques ou en mitose. Les macrophages thymiques corticaux semblent donc avoir d’autres fonctions que la phagocytose des thymocytes nécrosés. Le deuxième chapitre est consacré aux conditions de culture qui permettent d’obtenir les cultures les plus riches en cellules épithéliales, tout en maintenant leur différenciation. La culture d’explants dans un milieu habituel permet d’obtenir des fragments riches en cellules épithéliales après deux à trois semaines mais ile ne sont jamais pus. Dès les premiers jours, la nécrose des thymocytes corticaux est si intense qu’elle affecte les cellules étoilées et réduit ainsi les fragments à des régions essentiellement médullaires. Au terme de ces cultures, les cellules épithéliales restent différenciées mais les explants sont dépourvus de cellules épithéliales globuleuses et de cellules interdigitées. Ces cultures ne sélectionnent par un type épithélial unique. L’incubation d’explants en présence de désoxyguanosine élimine le plus rapidement les thymocytes mais ne permet pas d’obtenir des fragments purement épithéliaux. Après dix jours, des macrophages, des cellules épithéliales et quelques thymocytes persistent. La stimulation non spécifique des différents types cellulaires par la triiodothyronine ne peut être mise à profit dans ce type de culture et la toxicité de l’hydrocortisone utilisée « in vivo » ou « in vitro » limite son utilisation. La combinaison de milieux comprenant des cellules avec de D-valine est inefficace. Les filtres qui ont servi de support aux explants ne permettent pas d’obtenir des monocouches épithéliales pures. Les monocouches sur film de collagène, obtenues à partir de cellules nurses, sont riches en cellules épithéliales mais contiennent des contaminants non lymphoïdes. La détection des kératines permet de suivre l’évolution des cellules nurses et prouve la nature épithéliale des cellules d’aspect fibroblastique qui en dérivent. Celles-ci sont corticales ; les cellules globuleuses d’origine médullaire croissent d’emblée comme de vraies cellules épithéliales. Comme dans les explants, la nécrose des thymocytes au début de la culture est toxique pour les cellules épithéliales mais les lésions sont généralement réversibles et les cellules prolifèrent. Après huit jours, elles perdent cette capacité et sont dédifférenciées. La symbiose lympho-épithéliale est indispensable au maintien de leur différenciation comme le prouve la disposition des vacuoles claires et des antigènes Ia. Cette symbiose repose sans doute sur la sécrétion des lymphocytes car l’interféron-γ, lymphokine produite par les thymocytes même immatures, maintient l’expression des antigènes Ia. Au cours des sous-cultures, les contaminants non épithéliaux sont rares mais la prolifération épithéliale s’arrête. La taille des cellules, le nombre des cellules multinucléées, la taille des noyaux et leur irrégularité sont augmentés. La confluence ne s’obtient plus quel que soit l’additif sauf avec le pyruvate de sodium, ajouté au milieu dès la culture primaire. Lorsque celui- ci est utilisé, la prolifération épithéliale en culture secondaires est comparable à celle obtenue dans les cultures primaires. Les sous-cultures cependant ne sont jamais pures car les fibroblastes prolifèrent autant que les cellules épithélialesThèse de doctorat en sciences (histologie) (ISTO) -- UCL, 198

Les cellules non lymphoïdes du thymus murin in vitro

dissertn: Diss. Doct

The relationship between ovarian vascularity and the duration of stimulation in in-vitro fertilization.

The role of transvaginal pulsed colour Doppler ultrasound in the assessment of ovarian vascularity was studied in 196 in-vitro fertilization (IVF) cycles. The changes in ovarian blood flow after gonadotrophin-releasing hormone agonist (GnRHa) down-regulation and human menopausal gonadotrophin (HMG) stimulation were determined. The data obtained showed that the ovarian blood flow was significantly improved by oestradiol secretion (P = 0.05) and human chorionic gonadotrophin (HCG) administration (P = 0.003). Folliculogenesis was affected by blood flow supply. The resistance index (RI) value was significantly different (P = 0.05) according to the duration of ovarian stimulation. Patients with a mean RI value >0.56 had a longer stimulation with a significantly lower mean number of oocytes retrieved (P = 0.01) despite the administration of a standard dose of HMG. The RI value is a good indicator of modifications in ovarian vascularization during stimulation. Doppler blood flow measurement could be used to determine the optimal timing for the beginning of HMG administration in patients undergoing ovarian stimulation after down-regulation for IVF treatment

Efficacy of in vitro fertilization after chemotherapy.

OBJECTIVE: To evaluate if in vitro fertilization (IVF) with embryo cryopreservation can be proposed to patients immediately after one or two regimens of chemotherapy. DESIGN: Retrospective study. SETTING: Academic research center and IVF unit. PATIENT(S): Eleven young patients diagnosed with cancer between September 1999 and April 2003 who wanted to preserve their fertility via IVF. INTERVENTION(S): Stimulation and IVF before or soon after chemotherapy treatment. MAIN OUTCOME MEASURE(S): The number and quality of embryos obtained after stimulation in cancer patients undergoing IVF before or soon after chemotherapeutic treatment. RESULT(S): Four patients underwent IVF in the interval between two regimens of chemotherapy. Two of them had no follicular development; one underwent follicular puncture but no oocytes were retrieved; and, in one, six oocytes were harvested but only one good quality embryo was obtained. In the seven patients who underwent IVF before starting chemotherapy, between 4 and 11 embryos were obtained per patient, the majority being good quality embryos. CONCLUSION(S): Because the efficacy of IVF is dramatically reduced after even one round of chemotherapy, IVF should be performed before chemotherapy. For those who require immediate chemotherapy, ovarian tissue cryopreservation and/or oocyte cryopreservation could be used before treatment

Comparison of G1.2/G2.2 and Sydney IVF cleavage/blastocyst sequential media for the culture of human embryos: a prospective, randomized, comparative study.

Objective: To compare two commercially available sequential media, G1.2/G2.2 and Sydney IVF cleavage/blastocyst media, as supports for human embryo culture. Design: Prospective randomized study. Setting: University-based IVF clinic. Patient(s): Two hundred forty-nine patients undergoing IVF treatment for the first or second time, randomly allocated at the time of oocyte retrieval, to either culture in G1.2/G2.2 or Sydney IVF media. Intervention(s): Oocyte recovery, IVF or intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, transfer on day 3 or day 5/6. Main Outcome Measure(s): Developmental stage on day 3, blastocyst rate, pregnancy outcome as assessed by βhCG positive test, implantation rates, and ongoing pregnancies. Result(s): Embryos cultured in G1.2/G2.2 media displayed a faster kinetics of cleavage, compaction, blastulation, and hatching, but a lower day 3 embryo quality than those grown in Sydney IVF media. For patients with at least five embryos, G1.2/G2.2 media yielded higher implantation rates (26.2%) in our day 3 embryo transfer program when compared to Sydney IVF medium (15.5%), whereas similar implantation rates were obtained for day 5/6 embryo transfer for both media (43.1% and 36.1%, respectively). Conclusion(s): In our day 3 embryo transfer program, G1.2/G2.2 media were superior to Sydney IVF media, whereas both media yielded similar outcomes in our blastocyst transfer program

Est-il possible d'éviter les grossesses multiples en fécondation in vitro ? A propos d'une étude rétrospective sur 1735 tentatives.

Dans une étude rétrospective, reprenant 1735 cycles de fécondation in vitro, nous avons essayé d'identifier les paramètres les plus significatifs statistiquement en terme de grossesses multiples après traitement par Fécondation In Vitro. Nous avons limité le biais d'évaluation statistique en utilisant une régression logistique et considérant tous les paramètres interdépendants. Nos résultats montrent que les paramètres de stimulation, l'âge de la patiente, le nombre total d'embryons obtenus et le nombre et la qualité des embryons transférés influencent l'issue de la tentative. Par contre, seuls le nombre et la qualité jouent un rôle significatif au niveau du taux des grossesses multiples. Face à ces résultats, nous avons conclu qu'en présence d'une patiente présentant un bon pronostic en FIV, seulement 2 embryons de bonne qualité doivent être transférés quelque soit son âge ou le nombre de tentatives antérieures réalisées

Utilization rates and results of long-term embryo cryopreservation before gonadotoxic treatment.

Purpose: The aim of this study was to evaluate long-term embryo cryopreservation, utilization, and success rate in patients subjected to gonadotoxic treatments in the context of cancer. Methods: This is a retrospective study on patients (n = 54) undergoing ovarian stimulation and IVF for fertility preservation between January 1997 and June 2014. Embryos were slow-frozen and stored until the women were cured and able to undergo embryo transfer. Results: Fifty-four women underwent 66 oocyte pick-up procedures in total, and embryos were obtained from 52 of the 54 patients. Four patients died before their frozen embryos could be thawed. Of the remaining 48, 9 women returned to use their embryos, resulting in 6 pregnancies (66 % cumulative pregnancy rate), two of which ended in miscarriage. The live birth rate per patient was thus 44 % (4/9). The true come-back rate, calculated after applicable exclusions, was found to be 23 %. Conclusion: IVF followed by embryo freezing is a widely established technique for fertility preservation, but little has been published on the outcomes in cancer patients. While we found the number of good-quality embryos to be lower than in a normal population, the cumulative live birth rate was similar to that achieved with fresh embryos in non-cancer patients. The utilization rate of this fertility preservation method can be considered high

Predictive factors for multiple pregnancy in in vitro fertilization

OBJECTIVE: To study predictive factors influencing the multiple pregnancy rate in in vitro fertilization (IVF). STUDY DESIGN: Retrospective study. RESULTS: In 1,736 IVF cycles, 453 pregnancies occurred. The rate of singleton, twin and triplet pregnancies was 44%, 22% and 4.5%, respectively. Eighty-one percent of these clinical pregnancies ended with a delivery, giving a "take-home baby" rate of 23.8%/oocyte retrieval. As expected, a statistically significant positive correlation was found between the number and quality of embryos replaced and the occurrence of multiple pregnancies. A statistically significant correlation was also found when parameters such as age, stimulation parameters and embryo characteristics were incorporated into the analysis. This correlation was different for singleton, twin and triplet pregnancies. CONCLUSION: Based on the findings of this study, in patients with a good prognosis for IVF outcome, only two embryos of good quality should be replaced regardless of the maternal age or number of IVF attempts