D-Branes in Topological String Theory

This thesis is concerned with D-branes in topological string theory, focusing on the description of B-type D-branes in topological Landau-Ginzburg models. Such D-branes are characterized by matrix factorizations of the Landau-Ginzburg superpotential. After reviewing some aspects of topological string theory we give a detailed discussion of matrix factorizations. We discuss methods to calculate the effective superpotential in minimal models, putting emphasis on an algorithm to calculate the effective superpotential via deformations of matrix factorizations. We furthermore perform a non-trivial check of homological mirror symmetry for the torus.Comment: PhD thesis, 147+9 pages, 10 figure

Aspects of Twistor Geometry and Supersymmetric Field Theories within Superstring Theory

In this thesis, we report on results in non-anticommutative field theory and twistor string theory, trying to be self-contained. We first review the construction of non-anticommutative N=4 super Yang-Mills theory and discuss a Drinfeld-twist which allows to regain a twisted supersymmetry in the non-anticommutative setting. This symmetry then leads to twisted chiral rings and supersymmetric Ward-Takahashi identities, which, when combined with the usual naturalness argument by Seiberg, could yield non-renormalization theorems for non-anticommutative field theories. The major part of this thesis consists of a discussion of various geometric aspects of the Penrose-Ward transform. We present in detail the case of N=4 super Yang-Mills theory and its self-dual truncation. Furthermore, we study reductions of the supertwistor space to exotic supermanifolds having even nilpotent dimensions as well as dimensional reductions to mini-supertwistor and mini-superambitwistor spaces. Eventually, we present two pairs of matrix models in the context of twistor string theory, and find a relation between the ADHM- and Nahm-constructions and topological D-brane configurations.Comment: PhD thesis, 280 pages, 9 figure

Molecular Evolution of Short RNA Molecules Neutral Nets in Sequence Spaces and Kinetic Properties of RNA

Mathematik der Universit"at Wie

zur Erlangung des akademischen Grades

eingereich

Smac mimetics synergize with glucocorticoids to induce cell death in pediatric acute lymphoblastic leukemia

Resistance in glucocorticoid-induced apoptosis is associated with poor prognosis for long term survival in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). As Smac mimetics have been shown to reactivate apoptosis by antagonizing Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins, we investigate the potential of the Smac mimetic BV6 to overcome glucocorticoid-resistance in ALL. This study shows that BV6 synergistically cooperates with glucocorticoids to trigger apoptosis and to suppress clonogenic growth of pediatric ALL cells. Of note, the BV6/glucocorticoid combination treatment also induces cell death in cells having defects in the apoptotic signaling cascade by inducing a switch from apoptotic to necroptotic cell death. The clinical relevance of our novel combination treatment is underscored by parallel experiments in primary pediatric ALL samples, in which glucocorticoids and BV6 act together to induce cell death in a synergistic manner. Importantly, the addition of BV6 enhances the anti-leukemic effects of glucocorticoids in an in vivo mouse model of pediatric ALL without causing substantial side effects, highlighting the potency of a BV6/glucocorticoid combination treatment. In contrast, BV6 does not increase cytotoxicity of glucocorticoids against several non-malignant cell types of the lympho-hematopoietic system. Furthermore, we have identified the novel underlying mechanism of BV6/glucocorticoid-induced apoptosis by showing that BV6 and glucocorticoids synergistically act together to promote assembly of the ripoptosome, a RIP1/FADD/caspase-8-containing cell death complex. Ripoptosome assembly is critically required for BV6/Dexamethasone-induced cell death, since genetic silencing of its members, i.e. RIP1, reduces ROS production, caspase activation and most importantly cell death induction. BV6/glucocorticoid combination treatment promotes ripoptosome assembly by inhibition of both of its negative regulators, IAP proteins and cFLIP. Thus, we identify that BV6 and glucocorticoids cooperate together to reduce cIAP1, cIAP2 and XIAP protein levels and cFLIP expression. Ripoptosome formation occurs independently of autocrine/paracrine loops of death receptor ligands, since blocking antibodies for TNFα, TRAIL or CD95L or genetic silencing of their corresponding receptors fail to rescue BV6/glucocorticoid-induced cell death. In summary, this study shows that the Smac mimetic BV6 sensitizes for glucocorticoid-induced apoptosis by promoting ripoptosome assembly with important implications for the treatment of childhood ALL.Leukämie gehört mit 34% zu den am häufigsten diagnostizierten Krebserkrankungen im Kindesalter. Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist mit einer Inzidenz von 80% die am meisten auftretende Leukämieform. Aufgrund ihrer Fähigkeit effizient Tumorzellen zu töten, sind Glukokortikoide wesentliche Bestandteile der multi-modalen Chemotherapie in der Behandlung für ALL. Sensitivität gegenüber Glukokortikoiden ist ein wichtiger prognostischer Marker in der pädiatrischen Leukämie. Da Apoptose der hauptsächliche Zelltodmechanismus ist, der durch Glukokortikoide induziert wird, trägt eine Resistenz gegenüber der Glukokortikoid-induzierten Apoptose wesentlich zur schlechten Prognose und einem ungünstigem Krankheitsverlauf bei. Deswegen sind neue Therapiestrategien, bei denen apoptotische Signalwege reaktiviert werden, von entscheidender Bedeutsamkeit bei der Behandlung von Glukokortikoid-resistenter ALL. Apoptose gehört zu den am Besten charakterisiertesten Zelltodmechanismen und ist ein wichtiger Prozess in der Hämatopoese von Lymphozyten. Aufgrund des Apoptose-auslösenden Stimulus, können zwei verschiedene Apoptosesignalwege unterschieden werden, der Todesrezeptorvermittelte (oder auch extrinsische) und der mitochondriale (oder auch intrinsische) Signalweg. Inhibitor of Apoptosis (IAP) Proteine sind wichtige Negativregulatoren des Apoptosesignalweges. Dabei inhibiert XIAP durch Bindung mit seiner BIR Domäne die Aktivierung von Caspase-9, Caspase-3 und Caspase-7, während cIAP1 und cIAP2 prädominierend über ihr E3 Ligase Aktivität der RING Domäne Proteine wie RIP1 ubiquitiniert und damit Zelltodsignalwege hemmt. Aufgrund der Tatsache das IAP Proteine häufig in verschiedenen Krebsentitäten dereguliert sind, wurden pharmakologische Inhibitoren, so genannte Smac mimetics, entwickelt. Smac mimetics sind relativ kleine Moleküle, die das N-terminale Bindungsmotiv von Smac, einem endogenen IAP Antagonisten nachahmen, und damit an IAP Proteine binden und diese dadurch in ihrer Aktivität hemmen. Während Bindung von Smac mimetics an cIAP Proteine zu deren proteasomalen Degradation über Aktivierung der E3 Ligase und Autoubiquitinierung führt, inhibieren Smac mimetics die durch XIAP vermittele Hemmung auf Caspasen, wodurch diese aktiviert werden können. Ergebnisse von präklinischen und klinischen Studien belegen, dass Smac mimetics insbesondere bei Kombinationstherapien sehr effektiv sind, um Apoptosesignalwege zu reaktivieren und dadurch Krebszellen für die Chemotherapie-induzierte Apoptose zu sensitivieren. In der folgenden Studie soll untersucht werden, ob man die Sensitivität gegenüber einer Glukokortikoid-basierten Therapie mit einer Kombinationsbehandlung mit dem Smac mimetic BV6 in der pädiatrischen ALL wieder herstellen kann und damit ALL Zellen empfänglich für Glukokortikoid-induzierte Apoptose machen kann. Die Indikation, dass Smac mimetics für eine Kombinationstherapie in der ALL geeignet sind ergibt sich aufgrund der Tatsache, dass ALL Zellen von Kindern mit einer Glukokortikoid-Resistenz eine erhöhte Expression von IAP Proteinen aufweisen, was mit einer schlechten Prognose und Therapieresistenz assoziiert ist. Eine erhöhte XIAP Protein Expression steht ebenfalls in Verbindung mit einem schlechten Ansprechen auf eine Prednisontherapie von ALL Patienten und erhöhte cIAP Protein Levels können in der pädiatrischen ALL detektiert werden. Unsere Experimente belegen, dass die Kombination von Glukokortikoiden, wie z.B. Dexamethason und Prednisolon, mit dem Smac mimetic BV6 zur synergistischen Zelltodinduktion in pädiatrischen ALL Zellen führt, die eine initiale Resistenz gegenüber Glukokortikoiden aufweisen. Eine synergistische Wirkung der BV6/Glukokortikoid-Kombinationstherapie konnte nicht nur in ALL Zelllinien, sondern auch in primären Tumorproben von pädiatrischen ALL Patienten bestätigt werden. Bemerkenswerterweise trat der durch BV6/Glukokortikoid-induzierte synergistische Zelltod ebenfalls bei primären ALL Zellen auf, die von Patienten mit einer Hochrisiko-Erkrankung und einem Rezidiv stammen. Zudem belegt unsere Studie, dass BV6 auch die Dexamethason-induzierte Zytotoxizität in einem in vivo Mausmodell für pädiatrische ALL erhöht, ohne dabei substanzielle Nebenwirkungen zu verursachen. Die klinische Relevanz der BV6/Dexamethason- Kombinationstherapie wird durch die Tatsache belegt, dass BV6 und Dexamethason synergistisch Zelltod in ALL Zellen auslösen, während nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems nicht betroffen sind. So kann BV6 nicht den Glukokortikoid-induzierten Zelltod in peripheren Blutzellen, in mesenchmalen Stromazellen und in CD34-positiven Vorläuferzellen potenzieren. Außerdem hat die BV6/Dexamethason-Kombinationstherapie keinen Effekt auf die Differenzierung von Monozyten zu CD86-positiven Dendritischen Zellen. Durch diese Ergebnisse wird belegt, dass die Behandlung mit BV6 und Glukokortikoiden in Kombination ein therapeutisches Fenster besitzt, wodurch synergistisch Zelltod in pädiatrischen ALL Zellen ausgelöst werden kann, während bei äquimolaren Konzentrationen nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems verschont bleiben. Bei dem durch BV6/Dexamethason-induzierten Zelltod handelt es sich dabei um Apoptose, da BV6/Dexamethason synergistisch zusammenwirken, um typische Bestandteile der apoptotischen Signalkaskade zu aktivieren. So bewirkt eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung eine vermehrte Aktivierung von Caspasen, Aktivierung der proapoptotischen Proteine Bax und Bak, Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials, Freisetzung von Cytrom C aus dem Mitochondrium in das Zytosol und DNA-Fragmentierung. Ergebnisse dieser Studie zeigen neben der Entdeckung der neuartigen Kombinationstherapie, auch den zugrunde liegenden Mechanismus des durch BV6/Dexamethason-ausgelösten Apoptose. So kann belegt werden, dass BV6 und Dexamethason zusammen zur Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes führen. Das Ripoptosome ist ein zellulärer Komplex, bestehend aus RIP1/FADD/Caspase-8 und dessen Bildung und Aktivierung führt zur proteolytischen Prozessierung von Caspase-8 in seine aktive Form, wodurch letztendlich der Apoptosesignalweg induziert wird. Immunopräzipitations-Experimente aus dieser Studie belegen, dass es durch eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung zur vermehrten Assoziation von RIP1 an FADD und Caspase-8 kommt. Da Studien belegen, dass eine Assemblierung des Ripoptosomes insuffizient für dessen Aktivierung ist, zeigen wir zudem, dass BV6/Dexamethason neben der Bildung auch die Aktivität des Ripoptosomes potenzieren. Dies wird bewiesen durch (1) eine erhöhte Caspasenaktivität nachgewiesen durch deren Spaltung in die aktive enzymatische Form mit der daraus resultierender Aktivierung von untergeordneten Signalwegkaskaden, wie z.B. einem Verlust des mitochondrialen Membranpotenziales, einer Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium in das Zytosol und DNA-Fragmentierung. Des Weiteren kann gezeigt werden, dass es (2) durch genetische Runterregulation der Bestandteile des Ripoptosomes, wie z.B. RIP1 und Caspase-8, zu einer Inhibition der Caspasen-Aktivierung und einer daraus resultierenden Reduktion des apoptotischen Zelltodes kommt. Diese Experimente zeigen ebenfalls, dass die Assemblierung des Ripoptosomes ein proximales Ereignis ist, da die Störung dessen Bildung die Aktivierung von untergeordneten Apoptosesignalwegen verhindert. Ripoptosome Bildung und Aktivierung wird in der Regel durch zwei verschiedene Negativmodulatoren reguliert: IAP und cFLIP Proteine. IAP Proteine modulieren dabei die Verfügbarkeit der Ripoptosome-Komponenten durch deren Ubiquitinierung. So können cIAP Proteine RIP1 an K48-Resten ubiquitinieren und für dessen proteasomale Degradation sorgen oder wahlweise durch K63-Ubiquitinierung RIP1 an Rezeptor-Komplexe binden, um eine TNFα-induzierte Aktivierung des NF-κB Signalweges zu bewirken. In Abwesenheit von cIAP Proteinen, liegt jedoch RIP1 im unubiquitinierten Zustand vor und kann sich der cIAP-Protein vermittelten proteasomalen Degradation oder der Lokalisation am Rezeptorkomplex entziehen, wodurch es zellulär verfügbar wird, zusammen mit Caspase-8 und FADD das Ripoptosome zu bilden. Smac mimetics wie BV6 haben schon in vorherigen Studien belegen können, dass sie effektiv zur Reduktion von IAP Porteinen, insbesondere von cIAP1 und cIAP2 führen. Auch für Glukokortikoide, wie Dexamethason gibt es Belege, dass sie Proteinlevel von IAP Proteinen modulieren können, jedoch sind diese Daten teilweise sehr widersprüchlich. So konnte in einer Studie aufgeführt werden, dass Dexamethason zur Degradation von XIAP und cIAP1 führt, während ebenfalls belegt werden konnte, dass Dexamethason zur Hochregulation von cIAP2 führt. Unsere Studie ist die erste, in der gezeigt werden kann, dass BV6 und Dexamethason synergistisch interagieren, um IAP Proteine zu reduzieren. Wir suggerieren, dass dabei beide Substanzen synergistisch zur proteasomalen Degradation der IAP Proteine führen, weil der Proteasominhibitor Bafilomycin die durch BV6/Dexamethason-induzierte Reduktion von IAP Proteinen aufhebt. Dagegen zeigt der Autophagy-Inhibitor Bafilomycin und der Caspasen-Inhibitor zVAD.fmk keine Wirkung auf die BV6/Dexamethason-vermittelte Reduktion der IAP Proteine. Zusätzlich zu den IAP Proteinen, haben cFLIP Proteine inhibitorische Wirkung auf die Ripoptosome Aktivierung, indem z.B. cFLIPL mit Caspase-8 interagiert und deren volle Aktivierung blockiert. Unsere Studie zeigt, dass BV6 zu einer Vermehrten Expression von cFLIPL führt, diese aber in Kombination mit Dexamethason komplett aufgehoben wird. Zusätzlich zu Veränderungen auf Proteinebene, können wir zeigen, dass die Zugabe von Dexamethason den BV6-induzierten Anstieg in cFLIPL mRNA verhindert, was suggeriert, dass die BV6/Dexamethasone-Kombinationsbehandlung zur transkriptionellen Hemmung von cFLIPL führt. Da cFLIPL als ein durch NF- κB transkriptionell reguliertes Protein beschrieben ist, haben wir parallel zu der cFLIPL Expression auch die Aktivierung des NF- κB Signalweges analysiert. BV6 ist beschrieben als Einzelsubstanz sowohl den kanonischen als auch den nicht-kanonischen NF- κB Signalweg durch NIK Akkumulation und TNFα-Produktion zu stimulieren, während Dexamethason inhibierende Funktionen auf den NF-κB Signalweg hat. Unsere Studie zeigt, dass wenn beide Substanzen in einer Kombinationsbehandlung verwendet werden, primär die inhibierende Wirkung von Dexamethason auf den NF-κB Signalweg überwiegt. In Übereinstimmung mit bisherigen Studien, führt eine BV6 Einzelbehandlung zu einer Aktivierung des kanonischen, mit Phosphorylierung von IκBα, als auch des nicht-kanonischen Signalweges, mit vermehrter p100 zu p52 Prozessierung, sowie zu einer erhöhte NF-κB-DNA-Bindung im Vergleich zu Kontroll-behandelten Zellen. Im Gegensatz dazu, weisen Zellen die zusätzlich noch mit Dexamethason behandelt wurden, keine Aktivierung des NF-κB Signalweges auf, was durch fehlende Prozessierung von p100, Phosphorylierung von IκBα und reduzierte NF-κB DNA-Bindung belegt wird. Zusammenfassend lässt sich somit festhalten, dass es durch eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung zu einer vermehrten Ripoptosome Bildung und Aktivität kommt, indem BV6 und Dexamethason zusammen IAP Proteine und cFLIPL als zwei Negativregulatoren des Ripoptosomes herunterregulieren. Die Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes erfolgt dabei unabhängig von Todesrezeptorsignalwegen, da blockierende Antikörper gegen TNFα, TRAIL oder CD95L, die mit der Ligandenbindung an den Rezeptor interferieren, keinen Effekt auf den durch BV6/Dexamethason-induzierten Zelltod haben. Zudem führt eine genetische Runterregulation der korrespondierenden Todesrezeptoren zu keiner Veränderung im BV6/Dexamethason-ausgelösten Zelltod. Die Funktionalität der blockierenden Antikörper und der genetischen Runterregulation der korrespondieren Rezeptoren wird durch parallele Experimente mit entsprechenden positiv Kontrollen bewiesen, in denen die blockierenden Antikörper oder die genetische Runterregulation der Rezeptoren protektiv wirkt. Diese Daten belegen, dass es sich bei der Bildung des RIP1/FADD/Caspase-8 beinhaltendem Komplexes um das Ripoptosome und nicht um den Komplex II handelt, der per Definition zwar die gleichen Proteinen beinhaltet, aber abhängig von der Aktivierung der Todesrezeptoren gebildet wird. Zusammenfassend zeigte diese Studie zum ersten Mal, dass (1) Smac mimetics und Glukokortikoide synergistisch Apoptose in pädiatrischen ALL Zellen in vitro und in vivo auslösen, während nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems verschont bleiben, und dass (2) Smac mimetics und Glukokortikoide zusammen die Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes, eines RIP1/Caspase-8/FADD beinhaltendem Komplexes, bewirken, was subsequent zur Aktivierung von Caspase-8 und dadurch zur Induktion des apoptotischen Zelltodes führt. Abschließend lässt sich festhalten, dass die Ergebnisse aus dieser Studie wichtige Implikationen für zukünftige Therapiestrategien in der Behandlung der pädiatrischen ALL haben, dass jedoch die Potenz der aus Smac mimetic und Glukokortikoiden bestehende Kombinationsbehandlung und sowie deren Nebenwirkungen in weiteren, insbesondere klinischen Studien getestet werden muss

Elucidation of effector and regulatory mechanisms in a mouse model of food-induced gastrointestinal allergy

The prevalence of food allergies has increased in the westernized countries during the past decades. Clinical manifestations of food allergies involve the skin (e.g. atopic dermatitis), the respiratory tract (e.g. rhinitis, and asthma), the ocular area (e.g. conjunctivitis), the gastrointestinal tract (e.g. food-protein-induced enterocolitis syndrome, food-induced proctocolitis, and eosinophilic gastroenteropathies), and the cardiovascular system (e.g. anaphylaxis). A curative treatment of these diseases has not been established yet. Oral immunotherapy (OIT) has gained attention as a potential therapy for food allergies. Continuous feeding of allergenic diet applied in the model described here mirrors to a certain extent an OIT treatment. It might be therefore useful to investigate efficacy and safety of OIT pre-clinically. Mouse models have been widely used to analyse novel treatment approaches. Unfortunately, most of them have focussed on IgE-mediated hyperreactivity. Only a limited number of mouse models presenting mixed IgE- and non-IgE-mediated gastrointestinal symptoms and inflammation upon allergen-challenge are available. To study the mechanisms underlying the induction of food-induced gastrointestinal inflammation and subsequent oral tolerance induction, a mouse model of food-induced gastrointestinal allergy was established. BALB/c mice were sensitised with Ovalbumin (OVA) plus ALUM and subsequently challenged by feeding a diet containing egg white (EW diet). During the first seven days on EW diet, OVA-sensitised mice (OVA/ALUM EW mice) developed gastrointestinal symptoms (e.g. weight loss, ruffed fur, soft stool and less mobility) and inflammation in the small intestines accompanied by a strong induction of OVA-specific IgE antibodies and mouse mast cell protease-1 (mMCP-1). Proliferation of CD4+ T cells from spleen of OVA/ALUM EW mice was reduced compared controls. The result indicated that feeding EW diet induced T cell tolerance systemically. In contrast, CD4+ T cells isolated from MLN of OVA/ALUM EW mice showed stronger proliferation upon OVA stimulation in vitro than mice OVA-sensitised but fed a conventional diet, indicating that tolerance was not induced by short-term EW diet. Histological analysis of the small intestinal tissue of OVA/ALUM EW mice revealed strong inflammation present in the duodenum, jejunum and ileum at this time point. Interestingly, the observed symptoms in OVA/ALUM EW mice resolved spontaneously after 7 days on EW diet, if the feeding was continued. In the next steps the CD4+ T cell-mediated immune response after 28 days continuous EW diet was assessed and revealed that tolerance was induced systemically as well as locally. This was shown by reduced proliferation and cytokine secretion of CD4+ T cells from MLN of OVA/ALUM EW mice after long-term EW diet. However, the inflammation in the jejunum was aggravated instead of resolved at this time point of allergenic diet. Our results suggest that application of OIT in food-allergic patients with gastrointestinal inflammation may need to be reconsidered, since continuous administration of allergenic food may aggravate inflammation in the local tissue. Interestingly, only the jejunum was affected by a worsened condition, whereas duodenum and ileum resolved inflammation. In accordance to the observed jejunal inflammation mMCP-1 levels in the sera were not changed. Allergen-specific IgE levels did not reach baseline level after long-term EW diet, although they were reduced compared to levels in mice after 7 days on EW diet. This result suggests that residual OVA-specific IgE antibodies would promote the jejunal inflammation by sustained activation of mast cells. Furthermore, our results suggest that IL-4 produced by activated Th2 cells could be an effector molecule to induce intestinal inflammation. The second part of this thesis was aimed at verifying the hypothesis that IgE-mediated mast cell activation is a major effector mechanism in induction of chronic inflammation induced by long-term EW diet. For that mice deficient for FcεRI, a high affinity IgE receptor, were used. These mice were sensitised with OVA and fed EW diet as described for WT mice. Although FcεRI-deficient mice showed an intact Th2 immunity with IgE production, weight loss in the receptor-deficient mice was moderately induced by EW diet compared to WT mice, suggesting that this clinical symptom during the acute phase of allergic response is associated with IgE-mediated mechanisms. Surprisingly, the deficient mice presented comparable intestinal inflammation on day seven of EW diet as WT mice did. However, if EW diet was continued, recovery of intestinal inflammation was observed in FcεRI-deficient mice in contrast to WT mice. These results suggest that the induction of intestinal inflammation is not IgE-dependent. Nevertheless, this does not rule out a potential role of mast cells in the inflammation, because of their IgE-independent activation pathways. It also suggests the involvement of T cell-mediated mechanisms during induction of jejunal inflammation. Interestingly, the aggravated inflammation seen after long-term EW diet in WT mice seems to be IgE-dependent, considering that it was not observed in FcεRI-deficient mice. The elevated number of mast cells in the intestine of WT mice further led to a hypothesis that their continuous activation might be responsible for the chronification of allergic inflammation observed after long-term EW diet. In the context of OIT it further implies that IgE might be a poor prognostic factor for recovery of intestinal inflammation during and after an OIT treatment. In the third part of this thesis regulatory mechanisms employed by the immune system were analysed. Initial results from CD4+ T cells isolated from MLN from OVA/ALUM EW mice showed elevated IL-10 levels in their supernatants after short-term EW diet. IL-10-deficient mice were used to analyse the effect of this immunosuppressive cytokine in the mouse model presented here. However, IL-10-deficient mice tend to develop a strong Th1-dominated immune response. Nevertheless, an accelerated weight loss and slight inflammation of the jejunum was observed after short-term EW diet. Analysis of OVA-specific proliferation and cytokine production CD4+ T cells from Spleen and MLN of IL-10-deficient mice on EW diet suggested that systemic as well as local tolerance was induced after short-term and long-term EW diet feeding, respectively. The result suggests that IL-10 is dispensable for induction of T cell tolerance in our mouse model. However, the presence of functionally active Tregs was observed during this study in WT mice fed short-term EW diet, suggesting that Tregs might have an important role in regulating the systemic or local immune response. T cell deletion as an alternative immune regulatory mechanism was also observed. Additionally, the efficacy of continuous EW diet (mirroring to a certain extent an OIT treatment) in induction of permanent tolerance was assessed. In OVA-sensitised WT mice continuous allergenic diet was stopped after resolution of clinical symptoms and reintroduced after a defined period on conventional diet. Evaluating the weight development showed that reintroduction of EW diet induced weight loss again, but not as pronounced as seen after short-term EW diet. Also the CD4+ T cell-mediated response was elevated again upon allergen stimulation in vitro. The results suggested that permanent tolerance was not induced in the chosen feeding regime. The mouse model established and analysed here was used to investigate inflammatory and regulatory mechanisms underlying food-induced gastrointestinal allergy. It presents clinical symptoms and intestinal inflammation (Burggraf et al., 2011). This model is easy to be reproduced in different laboratories, and is useful for testing novel therapy approaches (Schülke et al., 2011; Bohnen et al., 2013). It further provides an opportunity to investigate basic mechanisms underlying OIT. This therapy approach is currently extensively investigated and our mouse model would help to understand the therapeutic mechanism of OIT.Die Häufigkeit nahrungsmittelinduzierter Allergien nimmt in den industrialisierten Ländern kontinuierlich zu. Bis heute konnte keine kurative (heilende) Therapie entwickelt werden. Es gibt eine Vielzahl symptomatischer Therapien, wobei nur eine strikte Vermeidung des Allergens effektiv das Auftreten von Symptomen verhindert bzw. zum Abklingen der Symptome führt. Nahrungsmittelallergien können systemische Anaphylaxis auslösen oder sich in den verschiedensten Organen manifestieren, wie z.B. im Auge (allergische Bindehautentzündung), in der Nase (allergische Rhinitis), auf der Haut (Atopische Dermatitis), in der Lunge (Asthma) oder im Darm (nahrungsmittelinduzierte gastrointestinale Allergie/Enteropathie). Zur Erforschung der zugrundeliegenden immunologischen Mechanismen einer Nahrungsmittelallergie eignen sich Mausmodelle besonders. Des Weiteren werden sie für die vor-klinische Testung von neuartigen Therapien genutzt, bevor diese in klinischen Studien am Menschen getestet werden. Es existieren bereits einige Mausmodelle, die IgE-vermittelte Nahrungsmittelallergien abbilden, jedoch nur sehr wenige, die auch nicht-IgE-vermittelte Phänotypen repräsentieren. Allergische Manifestationen im Darm sind divers und noch unzureichend verstanden. Zumeist sind sehr junge Kinder betroffen. Es konnte jedoch interessanterweise beobachtet werden, dass viele dieser Kinder die Allergie spontan mit steigendem Alter wieder verlieren. Es ist noch nicht klar, welche Mechanismen in diesen Patienten zur Wiederherstellung der Toleranz führen. In der vorgelegten Doktorarbeit wurde ein neuartiges Mausmodel der nahrungsmittelinduzierten Allergie mit entzündlicher Ausprägung im Darm etabliert und analysiert. BALB/c Mäuse wurden mittels intraperitonealer Injektion von Ovalbumin (ein Hauptallergen des Eiweiß, Gal D2), absorbiert an ALUM, sensibilisiert. Die Injektionen fanden in einem Interval von zwei Wochen statt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde das konventionelle gegen ein eiweißhaltiges Futter (EW-Diät) ausgetauscht und konstant über eine Periode von sieben oder 28 Tagen den Mäusen verfüttert. Ein erstes interessantes Ergebnis wurde durch die Analyse des Gewichtsverlaufes während der Diät erhalten. In den ersten sieben Tagen zeigten die Mäuse einen zunehmenden Gewichtsverlust und weitere optische Zeichen einer Erkrankung, wie z.B. gesträubtes Fell oder weichen bis schleimigen Stuhl, sowie verminderte Aktivität. Bemerkenswerterweise war dieser Zustand nicht konstant, spontan zeigte sich Besserung der Symptome bis zur Genesung wenn die Provokation auf bis zu 28 Tage verlängert wurde. Eine Analyse der allergenspezifischen IgE-Antikörper zeigte eine deutliche Induktion am siebten Tag der Diät. Die verlängerte Fütterung führte jedoch zu einer leichten Reduktion dieser Werte (das initiale Basalniveau wurde jedoch nicht erreicht). Gleichzeitig mit absinkendem IgE-Gehalt im Serum wurde ein ansteigender Level allergenspezifischer IgG1-Antikörpern gemessen. Neben der humoralen Immunantwort wurde ebenfalls die T-Zell-vermittelte Immunantwort in der Milz und den mesenterialen Lymphknoten untersucht. Eine erhöhte Proliferation und Zytokin-Sekretion (IL-4, IL-10) nach Stimulierung mit OVA in vitro konnte nur in CD4+ T-Zellen beobachtet werden, die aus den mesenterialen Lymphknoten von sensibilisierten und mit eiweißhaltiger Diät gefütterten Mäusen isoliert wurden. Humorale- und T-Zellantwort zusammengenommen, bestätigte die Induktion einer dominanten Th2-Immunantwort. Nach 28 Tagen EW-Diät war nicht nur der Gehalt an allergenspezifischen IgE-Antikörpern reduziert, auch die T-Zellantwort war signifikant reduziert. Die Daten der CD4+ T-Zellen aus der Milz zeigten weder erhöhte Proliferation noch Zytokin-Sekretion nach Allergenstimulierung in vitro. Aus diesen Daten kann resümiert werden, dass die Strategie des verlängerten, konstanten Fütterns der allergenhaltigen Diät systemisch als auch lokal T-Zell Toleranz induzierte. Die kontinuierliche Provokation mit einer allergenhaltigen Diät entspricht in groben Zügen einer oralen Immuntherapie, die zur Zeit als alternative Therapie zur Behandlung von Nahrungsmittelallergien diskutiert wird. Im Folgenden wurde der Zustand des Darms mittels histologischer Schnitte und verschiedenen Färbungen untersucht. Nach sieben Tagen EW-Diät konnte in OVA-sensibilisierten Mäusen eine akute Entzündung im Dünndarm festgestellt werden. Davon waren alle Bereiche des Dünndarms (Duodenum, Jejunum und Ileum), jedoch nicht der Dickdarm betroffen. Bei der Analyse der Gewebeproben des Darms nach 28 Tagen kontinuierlicher EW-Diät konnte in Jejunum-Proben eine noch weiter fortgeschrittene Entzündung festgestellt werden, wobei in den anderen untersuchten Teilen des Dünndarms keine Entzündung mehr festzustellen war. Dies war ein sehr interessantes und überraschendes Ergebnis, es zeigte, dass, obwohl T-Zell-Toleranz etabliert werden konnte, eine lokale Entzündung im Darm nicht unter Kontrolle gebracht werden konnte und sogar eine Verstärkung der Entzündung auftrat. In der Maus generierte Daten können natürlich nicht eins zu eins auf den Menschen übertragen werden. Trotzdem könnte dies jedoch ein Hinweis sein, dass Patienten mit einer im Darm manifestierten, nahrungsmittelinduzierten Allergie, unter oraler Immuntherapie, besonders überwacht werden sollten, hinsichtlich einer möglichen verstärkten Entzündung im Darm, verursacht durch die Therapie. In den darauffolgenden Experimenten wurde daher der Frage nachgegangen, welche Effektor-Mechanismen im hier vorgestellten Model der gastrointestinalen Allergie eine Rolle spielen. Einen ersten Hinweis lieferte die Analyse eines Aktivierungsmarkers für Mastzellen im Serum der Mäuse. In sensibilisierten und mit EW-Diät gefütterten Mäusen war eine signifikante Erhöhung des mMCP-1 Gehalts (mouse mast cell protease-1) detektiert worden, die auch über die verlängerte Provokation mit EW-Diät nicht abnahm. Diese Ergebnisse wurden durch die histologische Färbung für Mastzellen unterstützt, die zeigte, dass Mastzellen nach sieben Tagen vereinzelt im Gewebe vorliegen, jedoch in wesentlich höherer Anzahl nach 28 Tagen. Mastzellen, als Teil des angeborenen Immunsystems, sind wichtige Effektor-Zellen in der IgE-vermittelten Allergie. Die IgE-vermittelte Verkreuzung zweier FcεRI Moleküle auf der Oberfläche der Mastzellen führt zur sofortigen Aktivierung und Sekretion vorgeformter Entzündungsmediatoren und der Produktion von neu-synthetisierten Faktoren. Der Einfluss der IgE-FcεRI-vermittelten Mastzell-Aktivierung auf den in der Maus beobachteten Phänotyp wurde mit Hilfe FcεRI-defizienter Mäuse untersucht. In diesen Mäusen ist die IgE-FcεRI-vermittelte Mastzell-Aktivierung nicht möglich. Die Mäuse wurden wie beschrieben sensibilisiert und mit EW-Diät provoziert. Ein erster Unterschied zu den Wildtyp-Mäusen wurde bei der Analyse des Gewichts festgestellt, als nur ein sehr geringer Provokations-induzierter Gewichtsverlust beobachtet werden konnte. Dies implizierte, dass der beobachtete Gewichtsverlust in den ersten sieben Tagen der EW-Diät eine IgE bzw. FcεRI-abhängige Reaktion ist. Bei den allergenspezifischen Antikörpern konnte zunächst kein Unterschied zu den Wildtyp-Mäusen festgestellt werden. Auch die T-Zell-vermittelte Immunantwort zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Maus-Stämmen. Zusammengefasst zeigten diese Resultate, das allein die Präsenz von IgE kein Toleranz-inhibierender Faktor ist, da systemisch als auch lokal T-Zell-Toleranz induziert wurde. Aufgrund der zuvor in den Wildtyp-Mäusen erhaltenen histologischen Ergebnisse wurde in den folgenden Experimenten nur das Jejunum des Dünndarms untersucht. Eine Analyse des Jejunums von FcεRI-defizienten Mäusen nach Sensibilisierung und siebentägiger EW-Diät zeigte zu unserer Überraschung eine vergleichbare Entzündung des Gewebes, wie zuvor in den Wildtyp-Mäusen beobachtet. Dies lies vermuten, dass die Entzündung, sichtbar nach den ersten sieben Tagen der Provokation, eine von dem Vorhandensein des FcεRI-Rezeptors unabhängige Reaktion ist. Weiterhin implizierte es, das die IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung ebenfalls keine Rolle für das Entstehen der Entzündung spielt. Damit konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass alternative Wege der Mastzell-Aktivierung, wie z.B. Zytokine oder IgG-Antikörper hier einen Einfluss haben. Sehr wahrscheinlich ist jedoch, dass der Einfluss von Effektor-T-Zellen im Gewebe zu dem beobachteten Phänotyp geführt hat. Bei der Untersuchung des Jejunum-Gewebes nach 28 Tagen EW-Diät stellte sich heraus, dass sich die FcεRI-/- Mäuse von der Entzündung erholt hatten. Es wurden keine typischen Entzündungszeichen, wie Verdickung der Basallamina, Becherzell-Hyperplasie, Verlängerung der Krypte oder ein Verlust der Zotten-Struktur, wie zuvor in Wildtyp-Mäusen beobachtet wurde, festgestellt. Diese Ergebnisse wurden weiterhin durch die mMCP-1 Daten aus dem Serum der OVA-sensibilisierten und provozierten FcεRI-defizienten Mäuse unterstrichen. mMCP-1 wurde dzunächst auf ein vergleichbares Level induziert, jedoch führte kontinuierlich fortgeführter Provokation zu einer stetigen und signifikanten Abnahme. Dies zeigte, dass der beobachtete Gewichtsverlust und die Chronifizierung der allergischen Entzündung im Darm, jedoch nicht die initiale Entzündung im Darm eng mit der Präsenz des FcεRI und damit mit IgE-induzierten Mechanismen zusammenhängt. In einem fortführenden Experiment wurden Mastzellen mittels intravenöser Injektion eines Anti-ckit-Antikörpers depletiert, was ebenfalls dazu führte, dass kein Gewichtsverlust oder andere Erkrankungserscheinungen zu beobachten waren. Die Detektion erhöhter Mengen des immunsuppressiv wirkenden IL-10 im Überstand von allergenstimulierten CD4+ T-Zellen aus sensibilisierten und provozierten Mäusen, veranlasste die Vermutung das regulatorische T-Zellen in der Erholungsphase und der Induktion der T-Zell-Toleranz auf systemischer und lokaler Ebene eine herausragende Rolle spielen. Um der Frage nachzugehen, welche regulatorischen Prozesse in diesem Mausmodell eine Rolle spielen, wurden IL-10-/- Mäuse verwendet. Sie wurden sensibilisiert und provoziert wie beschrieben und zeigten nach sieben Tagen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen noch massiveren Gewichtsverlust, einhergehend mit einem augenscheinlich schlechteren Gesamtbefinden der Tiere. Dies deutete darauf hin, das IL-10 einen protektiven Einfluss in der initialen Phase der allergischen Reaktion hat. Interessanterweise, erholten sich die Mäuse in vergleichbarer Art und Weise wie die Wildtyp-Mäuse wieder von den am Beginn der Provokation gezeigten Anzeichen einer allergischen Erkrankung. Die Analyse der allergenspezifischen Antikörper zeigte eine sehr geringe und nicht signifikante Induktion der IgE-Antikörper, eine niedrigere Menge an IgG1-Antikörpern, aber erhöhte Mengen an IgG2A Antikörpern. Auch die T-Zell-vermittelte Immunantwort untersucht anhand der CD4+ T-Zellen der Milz und mesenterialen Lymphknoten zeigte auffällige Unterschiede, vor allem in Form erhöhter IFN-γ Mengen. Diese Ergebnisse passten jedoch in die Literatur, die zu IL-10-/- Mäusen veröffentlich wurde. Darin wurde für diese Mäuse eine spontane durch Th1 und Th17-Immunantworten-vermittelte, Kolitis beschrieben. Daher werden diese Mäuse auch bevorzugt für „Inflammatory Bowel Disease“-Modelle verwendet. Dieser Th1-dominierte Hintergrund in den Mäusen macht es schwierig, eine Th2-vermittelte allergische Reaktion zu etablieren, daher konnte auch nur eine wesentlich moderatere entzündliche Veränderung im Darmgewebe festgestellt werden. Die Vermutung liegt nahe, dass die Th1-orientierten Immunprozesse in der Maus, mit denen durch die Behandlung induzierten Th2-orientierten Immunantworten sich gegenseitig inhibierten. Dies führte weiterhin zu der Schlussfolgerung, dass die in dieser Maus erhaltenen Ergebnisse nur schwierig in das Gesamtbild zu integrieren waren. Zusammenfassend kann jedoch gefolgert werden, dass die Erholung von den anfänglichen Erkrankungserscheinungen unabhängig von IL-10 auftreten kann und dass T-Zell-Toleranz IL-10 unabhängig etabliert werden kann. In einem weiteren Experiment sollte die Frage geklärt werden, ob in unserem Mausmodell funktionelle regulatorische T-Zellen induziert wurden. Für die Isolation der CD4+CD25+ T-Zellen wurde der siebte Tag nach Provokationsbeginn gewählt, da dieser einen Übergang von akuter allergischer Antwort zur Genesung zeigt. Um die Funktionalität der regulatorischen T-Zellen zu überprüfen, wurde ein Proliferations-Inhibitions-Test durchgeführt wofür CD4+CD25+ und CD4+CD25- T-Zellen zusammen kultiviert (unter Stimulierung mit Allergen) und die Proliferation gemessen wurde. Es zeigte sich das die Proliferation von CD4+CD25- T-Zellen effektiv durch Co-Kultivierung mit CD4+CD25+ T-Zellen inhibiert werden konnte. Dies wies darauf hin, dass nicht nur allergenspezifischen Effektor T-Zellen induziert wurden, sondern auch funktionelle, allergenspezifische regulatorische T-Zellen. Ein weiterer toleranz-induzierender Mechanismus, der in diesem Mausmodell durchweg beobachtet werden konnte, ist die T-Zell-Depletion, welche durch hohe Antigen-Dosen vermittelt wird. Dafür wurde die Häufigkeit der CD4+ T-Zellen mittels FACS ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der CD4+ T-Zellen mit fortschreitender Provokation immer mehr abgenommen hat. Unter klinischen Allergologen wird intensiv debattiert ob orale Immuntherapie effektiv orale Toleranz wiederherstellen kann. Zurzeit gibt es leider kaum Langzeitstudien die dieser Frage nachgegangen sind, es wird daher davon ausgegangen das OIT zu e